拟茎点霉抗肿瘤活性物质的初步分离(3)_毕业论文

　

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Na OH 分析纯

(NH4)2SO4 分析纯

2.1.2.2 溶媒萃取试剂

分析纯试剂：氯仿、四氯化碳、苯、乙酸乙酯、正丁醇

2.1.2.3 层析试剂

按4:1的体积比将苯和甲醇混合，滤纸用0.5mol/L pH=7.0磷酸缓冲液浸泡过夜，自然晾干；

水饱和正丁醇；

正丁醇饱和的0.5mol/L的pH=7.0磷酸缓冲液；

按1:1:2的体积比将水、醋酸和丁醇混合；

甲醇：水=3:1，氯化钠质量占总溶剂3%，滤纸用5%硫酸钠溶液浸泡过夜，自然晾干；

水饱和正丁醇含2%六氢吡啶。

2.1.2.4纸电泳缓冲液

pH=8.0的磷酸缓冲液配制方法：

量筒量取0.2mol/l的Na2HPO4溶液81ml，加入到900ml灭菌水中混合，再用量筒量取0.2mol/l的NaH2PO4溶液19ml，倒至以上混合液中混合，定容至1L，高压灭菌，既得。

pH=4.0的磷酸缓冲液配制方法：

量筒量取0.2mol/L 醋酸钠溶液18ml，倒至100ml磷酸缓冲液中混合，再加入0.2mol/L 稀醋酸溶液82ml，充分混合，既得。

2.1.3仪器设备

锥形瓶；培养箱；超净台；滤纸；细菌滤器；烘箱；恒温水浴锅；

超速冷冻离心机；pH值测试仪；分液漏斗；烧杯；磁力搅拌器；

吹风机；层析缸；紫外分析仪；电泳仪；培养皿；高压灭菌锅。

2.2 试验方法

2.2.1菌种发酵

挑取带有菌种的培养基分别放入PDA液体培养基中，在培养箱中发酵培养20d。此步最重要的是无菌操作。发酵液用滤纸粗滤，然后用细菌过滤器再次过滤，过滤后的发酵液装入灭过菌的锥形瓶，置于4℃冰箱。

将肿瘤细胞在96孔板中铺板12h后，向其中加入10μl发酵液，每种3个复孔，处理24h后，加入MTT，每孔10μl，37℃培养4h后，使用酶标仪测定其OD560及OD670，并根据结果计算它们对肿瘤细胞的抑制率[1]。文献综述

2.2.2 菌丝体预处理方法

拟茎点霉菌种分装在50ml锥形瓶中发酵培养20d，备用。用普通漏斗过滤发酵液，保存拟茎点霉菌丝体。取菌丝体30g，对菌丝体进行反复冲洗，然后沥干菌丝体上的水分。

将冲洗干净并沥干水分的菌丝体一分为二，分别加15ml蒸馏水和15ml无水乙醇提取菌丝体中的抗肿瘤活性物质，2d后离心，分别取浸提液，平铺于培养皿中，在烘箱中烘干，各加PBS磷酸盐缓冲液3ml溶解，用未处理的发酵液原液作为对照，检测抗肿瘤生物活性[2]。

2.2.3 加热法处理发酵液

将若干个装有1ml发酵液原液的离心管置于恒温水浴锅，调节温度60℃~100℃不等，过30min后，离心30min，12000rpm，得到沉淀和上清液。用未处理的发酵液原液作为对照，检测沉淀及上清液的抗肿瘤生物活性。

2.2.4 调节pH值法处理发酵液

用10个50ml离心管分别装少量发酵液原液，用pH仪检测原液的pH值，记录。向离心管中滴加浓度低的稀盐酸或氢氧化钠溶液，使pH值在3-12。然后离心30min，12000rpm，用未处理的发酵液原液作为对照，检测沉淀及上清液，的抗肿瘤生物活性。

2.2.5 无水乙醇直接沉淀法处理发酵液

在冰箱4℃中存放拟茎点霉发酵液原液1ml和无水乙醇（分析纯）5ml，1h后取出。在冰箱-20℃中放置以上两种溶液的混合液，12h后取出，每个1.5ml离心管装入1ml混合液，离心30min，12000rpm，用未处理的发酵液原液作为对照，检测沉淀的抗肿瘤生物活性。来!自~751论-文|网www.751com.cn

同时将上清放在培养皿中，置于50℃烘箱中蒸去无水乙醇后，加入1ml PBS磷酸盐缓冲液溶解，进行生物活性侧定，以发酵液原液作为对照处理[3]。

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