光学显微相位成像在细胞形态检测中的应用研究(4)

菜单

1.2.3 超分辨率显微镜

自从1873年的Ernst Abbe第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认，显微镜的分辨率有极限，该极限与光源的波长有关。直到一个多世纪以后，罗马尼亚物理学家Stefan Hell推翻了这一观点。他是首位不仅从理论上论证，而且用实验证明了使用光学显微镜能够达到纳米级分辨率的科学家。

传统的显微技术受到衍射极限的限制，使得生物学家无法观测到水平方向低于200nm的细胞器结构。然而在最近的十年内，许多研究组提出了一系列的超分辨显微技术，包括德国马普生物物理化学研究所的Stefan Hell教授发明的受激辐射光淬灭(STED)技术，和霍华德休斯医学研究所(HHMI)的Eric Betzig、哈佛大学庄小威教授等人发明的随机光学定位重构显微(PALM/STORM)技术，以及加州大学San Francisco分校的Mats Gustaffson教授发明的饱和结构光学显微技术。其中，由于STED直接在物理学家熟悉的点扩展函数上进行调制，因此能够实现更快的成像速度，且不特别依赖于荧光染料，因此备受关注。文献综述

受激发射损耗（STED）显微技术其原理是通过物理过程来减少激发荧光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率，可以快速地观察活细胞内实时变化的过程，目前已成为一种成熟的超分辨率显微成像技术，应用于细胞生物学细胞观察中。另外，还可以应用单分子成像的极高的定位精度和变种荧光蛋白(PA-GFP)的荧光激发及漂白特性来突破光学显微镜的分辨率极限。随机光学重构显微技术(STORM) 和光敏定位显微技术(PALM) 正是这类超分辨率荧光显微镜的典型技术。但是这些方法也存在局限性，STED作为一种成熟的方法，已经可以高速地监测活细胞内高分辨率图像，但是缺陷在于光路复杂，设备昂贵，对系统的稳定性要求很高。不管是STORM还是PALM的超分辨率成像方法，其点扩散函数成像仍然与传统显微成像一致。由于需要反复激活-猝灭荧光分子，所以使得实验大多数在固定的细胞上完成。即使是在活细胞上进行的实验，其时间分辨率也较低。另外，这些方法均需要对样品进行荧光染色，会对细胞造成破坏，限制了它们的应用范围。

1.2.5 光学相干层析断层技术（Optical Coherence Tomography，OCT）

光学相干层析技术是一门无侵入、无损害、且具有高分辨率，依赖光学干涉技术的医学成像技术。其利用生物组织的高散射性，基于迈克尔逊干涉仪等干涉装置对样品进行成像。采用低相干光干涉，通过外差技术探测器探测干涉信号，还原原始信号得到样品图像。

OCT系统的核心是以干涉为基础，在此基础添加相关增强效果器件。如可利用光纤作为传输介质，用自聚焦透镜代替普通光学透镜成像等。低相干光源发出的光耦合进入干涉仪，通过一个光纤耦合器使光分别进入干涉仪的参考光路与样品光路。物光经过一个共焦系统再经散射介质的背向散射后沿原路返回，在光纤耦合器与参考光路返回的参考光干涉。由于采用的是低相干光，相干长度很短，所以只有从散射介质中很薄一层中反射回来的光才会和参考光发生干涉。通过光电探测器探测干涉信号，经过信号处理后进入电脑分析得到生物组织内部的像。

OCT技术具有比CT、超声等成像设备更高的分辨率，所以其在生物医学中的医用有着更加广阔的应用空间。甚至还可通过其他辅助办法提高轴向和横向分辨率，例如利用飞秒激光通过光纤非线性效应产生连续光谱使轴向超分辨，采用倏逝波或等离子波提高横向超分辨。但是，在实际应用中，整个光路的色散又限制了光谱宽度，由此可以在光路中加入色散补偿，然而同时也增加系统复杂度。其次，由于噪声的干扰，本身探测信号就很微弱，所以很容易被噪声湮没。