光学显微相位成像在细胞形态检测中的应用研究(5)

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1.2.6 流式细胞仪

流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节分辨率为零，而且无法成像。

1.3 定量相位测量技术简介

无论是成像或是非成像技术，每种方法都主要关注生物细胞检测的不同方面及侧重点。然而相对于各种非成像技术，成像技术由于其直观，能够在单一平台上实现多模式成像，以及后期可处理等等特点，使其一直成为生物观察，生物样品检测领域中的主流技术。而且生物成像不仅在生物领域，在物理，化学等众多领域中都有其独特以及实用的特性，各个领域的研究人员都在积极研发具有不同特性的生物样品成像技术。本文主要关注生物显微成像技术中的定量相位干涉显微成像技术。

定量相位显微技术按照采集方式可以分为单点定量相位显微技术和全场定量相位显微技术。

(1)单点定量相位显微技术

单点定量相位显微技术通过测量生物细胞上特定点的定量光相移信息，给出细胞的结构、相位分布、相位分散及双折射性质等信息，可以看作是光学相干层析(OCT)的推广技术。该技术可用单个探测器对定点进行高速相位成像，也可以用光纤扫描，最终实现生物细胞的显微成像，代表方法有偏振灵敏OCT、相散显微技术、相散光层析技术和谱域相位显微技术等。偏振灵敏OCT可以测量深度分辨率的双折射特性，量化视网膜神经纤维的相移值，观测神经的电活动，实时检测心肌细胞的跳动等；相散显微技术利用基光和二次谐波光干涉，检测色散和弱散射样品的相位，弥补传统的OCT技术对弱散射体观察能力的不足；相散光层析技术基于低相干光的相位测量，能够获取深度高分辨率的相位信息；谱域相位显微技术，能够用于活细胞的纳米尺度运动的测量，这种谱域相位显微技术比时域方法具有更高的相位稳定性，并且不需要时域方法获取稳定的相位所必须的双光束干涉，通过加大光源的谱宽就能使这种技术用于三维定量相差显微成像。虽然这些技术都能对生物细胞进行定量相位显微测量，但是均为单点式成像的，如果要对整个生物体成像，需要利用空间或者时间扫描，实现过程耗费时间，装置繁琐，应用范围有限。

（2) 全场定量相位显微技术

对于生物细胞以及亚细胞结构来说，单点检测由于速度慢、视场小，应用受到限制。而一些大视场的全场定量相位显微技术越来越受到科研人员的关注，因其具有定量相位测量，实时性好，观察范围广等特点，被广泛应用于研究生物细胞特性，并有望投入未来的生医检测中。

全场定量相位显微技术主要有两种方法：一是基于能量传输公式，或者是衍射方程等光波传输方式通过多幅离焦与在焦显微图得到最终的相位分布。该方法能够与商业显微镜相结合，然而，由于一般需要多幅显微图才能获得最后的相位分布，其时间分辨率低，难以实现实时成像。另一种方法主要基于干涉测量，将干涉装置与显微装置相结合，对视场内的样品进行干涉图采集，继而通过相位恢复算法，得到生物样品的定量相位分布。该方法简单且容易实现，且其选择模式灵活，既可以实现实时的单幅干涉图成像，亦可以实现同轴移相成像。