4.3 目的基因的扩增    27
4.3.1 引物的设计    27
4.3.2 PCR扩增的结果    28
4.3.3 pET21a大片段酶切的结果    28
4.3.4 EstMC1、 EstMC2、EstMC3和EstMC4酶切的结果    29
4.4 重组菌的发酵及酶活测试    29
4.4.1 细胞的破碎    29
4.4.2 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度    30
4.4.3  对硝基苯酚酯测定方法    31
4.4.4  重组酯酶的酶学性质表征    31
4.5讨论与总结    35
致  谢    36
参考文献    38
1 前言
1.1 酯酶的介绍
酯酶是酶中的一大类，其氨基酸序列中含有催化三联体结构和保守的五肽序列。
1.1.1 酯酶的分类
1999 年，Arpigny JL和Jaeger KE 两人根据细菌脂肪水解酶类的来源，序列分析及酶学性质分析等将其分为八大家族[7]。其中家族 I 的脂肪酶是“真正的脂肪酶”，家族 II 至家族 VIII 的成员属于酯酶类。家族 I 的成员较多，研究最早，也最深入，在工业生产和生物技术方面的应用最广泛。主要包括假单胞菌属脂肪酶，这类酶被广泛地应用于工业生产中。家族II又称为 GDSL 家族，因为 GDSL基元取代了保守的GXSXG五肽序列。这类水解酶表现出多功能性，并且底物选择谱广泛，其结构基础可能在于活性部位的柔性，即底物与活性部位结合后通过诱导契合模式发生了构象的变化。GDSL 水解酶不同于其他脂肪酶的催化机制还有待于进一步的研究。家族III的主要成员是来源于 Streptomyces sp.的酯酶，其与人血小板激活因子乙酰水解酶（PAF-AH）有 20%的序列同源性。家族 IV又称为荷尔蒙敏感酯酶（HSL）家族，与哺乳动物HSL有很高的序列同源性。家族V的成员分布于不同的热环境之中，且表现出与非脂水解酶高度的序列同源性。家族VI 成员包括分子量最小的酯酶，其分子量大小范围23-26kDa。家族 VII 成员则普遍具有较大的分子量（约55kD），其与真核的乙酰胆碱酯酶以及消化道/肝羧基水解酶有很高的同源性。家族VIII由Arthrobacter globiformis、Streptomyces chrysomallus、Pseudomonas fluorescens SIK W1的脂肪酶组成，其与C类β-内酰胺酶在序列上高度同源（40%）[1,5]。
1.1.2 酯酶的立体结构和催化机制
许多研究实验都通过生物化学以及结构分析的方法,对酯酶的结构和水解底物机制进行了深入研究[8-10]。对酯酶晶体结构的研究更是为我们认识酯酶提供了便利。酯酶的立体结构与众多α/β折叠水解酶的结构很类似。即由8个平行的β折叠组成一个中心,从第三个到第八个β折叠片之间分别有α螺旋相连接,排列在β折叠片的两边。β折叠片左手超螺旋扭曲,导致即和郎在空间上以近似90度的夹角互相交叉。这种α/β水解酶的折叠结构为酯酶活性位点提供了一个稳定的支架[11]。与脂肪酶相似似,酯酶有一个催化三联体的活性中心,由丝氨酸、组氨酸以及谷氨酸或是天冬氨酸残基组成。此活性位点往往由一个约1.0-1.5nm深的口袋组成。这个口袋排列着主要的疏水性残基。大的口袋由两种不同的结构域组成:一个大而有弹性,另一个小而坚硬。这两个结构域有利于酶对不同化学性质底物的结合和识别 [12]。有研究表明,酯酶与脂肪酶在结构上的不同,是脂肪酶在酶分子表面有一段α螺旋形成的“盖子结构”覆盖在活性中心上方。这个盖子和酶与底物的结合有重要的意义。一旦环境中有疏水性物质存在,盖子结构疏水一侧暴露到脂相中,加强了酶与脂表面的疏水作用,于是盖子结构被打开,使得脂肪酶暴露到一个疏水表面,底物与活性中心催化残基结合[13]。 巧克力微杆菌中酯酶的克隆表达及性质研究(2):http://www.751com.cn/yixue/lunwen_25496.html