基于Poly （T）稳定的荧光铜纳米颗粒非标检测核酸外切酶的活性(2)

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Exo Ⅲ作为一种十分重要的工具酶，在生物制药、生物工程、生化传感等方面都有其重要的用途[6-7]。传统的检测Exo Ⅲ的方法有：高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫分析法(ELISA)、放射性同位素标记法等[8-12]，这些传统的方法虽然促进了ExoⅢ的检测及分析，但是仍存在试剂昂贵、用时较长、操作复杂以及同位素标记等缺点。所以，发展新型、快速、低成本的Exo Ⅲ的检测方法一直是人们研究的热点。

近年来，贵金属原子纳米颗粒由于其强而稳定的荧光发射，可用于体外生物化学传感和体内成像，再加上其具有简单、灵敏和较低成本的优点，引起了人们强烈的研究热潮和广泛的关注[13-16]。例如，金纳米颗粒[17,18]和铂纳米簇[19,20]被用于蛋白质的荧光检测及癌细胞的生物成像。凭借其独特的纳米结构，出色的可设计性质，以及与一些贵金属离子的强的结合力，DNA已吸引了研究者的研究兴趣，并已筛选出通过以DNA为模板化学还原该DNA从而合成金属纳米颗粒。这些以DNA为模板的荧光纳米粒子显示出高的耐光性和可调荧光发射，适合于生物化学所关注的诊断技术。例如，已筛选出富含胞嘧啶的DNA可作为高荧光银纳米团簇形成的一个理想模板，并已成功地应用于单核苷酸突变鉴定、离子检测、小分子检测、蛋白质检测、癌症小区检测，体内成像和离子调谐逻辑器件等[21-23]。

近来，随着以DNA为模板合成荧光纳米颗粒的发展，人们已经发现单链聚（胸腺嘧啶）（Poly T）[24-25]的DNA可作为合成荧光Cu NPs的模板[26-28]，该法具有简单、快速、稳定性好等优点，引起了极大的关注。而且，以不同的DNA为模板合成荧光Cu NPs已被系统地筛选出来。例如，Qing等人发现以单链聚T DNA为模板可以选择性地合成荧光Cu NPs，该方法合成效率较高，反应迅速。而且这种方法合成的荧光铜Cu NPs有极大的斯托克斯位移，可在生物化学分析中有效的避免复杂样品所产生的干扰背景，是一种非常合适的分析信号的工具。此外，以 Poly T为模板合成的荧光Cu NPs与DNA为模板合成的Cu NPs相比，具有其独特的性质：（1）制备简单，只需混合几种试剂；（2）合成条件温和，室温下合成且无严格的操作步骤；（3）以Poly T为模板合成的荧光Cu NPs反应高效，可在非常低浓度的Poly T溶液中生成；（4）合成反应速度快，可在几分钟内完成；（5）铜是所有活的动物和植物显著且必需的微量元素，应用荧光Cu NPs应该比其他重金属纳米颗粒更安全。因此，由于它的简单、高效、快速以及低毒，以Poly T为模板合成的荧光Cu NPs在各个领域具有巨大的潜力。而且，这种合成方法的应用与探索仍然处于非常初级的阶段。

本论文基于Poly T为模板来合成荧光Cu NPs的原理，提出一种非标的荧光检测Exo Ⅲ活性的新方法。利用Cu NPs的合成对DNA模版的选择性，目标Exo Ⅲ降解DNA发夹探针（HP）释放游离的Poly T DNA，进而作为模版合成荧光Cu NPs。无Exo Ⅲ时，HP不能作为合成Cu NPs的有效DNA模版，只有微弱的荧光信号。目标Exo Ⅲ的浓度与酶切释放的Poly T DNA的浓度成正比，进而正比于荧光强度。该方法无需荧光标记、成本低、操作简便，是首次报道利用基于Poly T稳定的荧光Cu NPs检测Exo Ⅲ的活性。

1实验部分

1.1 实验仪器

CaryEclipse型荧光光谱仪（安捷伦（美国）科技有限公司）；FE20K型台式酸度计（梅特勒-托利多国际股份有限公司）；电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；MicroPette手动（可调式）移液器（大龙兴创实验仪器（北京）有限公司）。

1.2 实验试剂和药品

硫酸铜(CuSO4)、抗坏血酸钠和3-(N-吗啡啉)丙磺酸（MOPS, free acid）均为分析纯，于生工生物工程（上海）股份有限公司购买得到。Exonuclease Ⅲ(Exo Ⅲ)和dNTPs mixture购于NEB（北京）有限公司。实验通用缓冲液为MOPS 缓冲液，组成为150 mMNaCl，10 mM MOPS，1 mM MgCl2，pH＝7.5。实验用水为纯水，从生工生物购买。寡核苷酸序列（HP）在指导老师帮助下设计完成，从生工生物订购纯化，序列如下：(5'-3')