HP-8: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAA
HP-10: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAA
HP-12: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAA
1.3实验步骤
实验的准备:实验用DNA链均用MOPS缓冲液溶解成30 M,分装保存备用。先将分装的DNA链取出一管,稀释成15 M,淬火处理后室温保存备用。
取7个容量为0.6 mL的离心管,分别标记为1~7,加入10 µL(15 M HP-12),然后分别加入36 µL、38 µL、35 µL、38 µL、39 µL、39.5 µL、40 µL的MOPS缓冲溶液,混匀后,加入Exo Ⅲ凑成50 µL反应液,再混合均匀,在37℃恒温水浴锅中反应1h。-源^自,751<文.论(文]网>www.751com.cn接着分别加入230 µL MOPS缓冲溶液,10 µL(60 mM)抗坏血酸钠溶液(现配),振荡混匀后,加入CuSO4(6 mM)溶液10 µL,于25 ℃恒温水浴锅中放置10 min。然后进行荧光检测,并做好实验记录与数据处理。参数设置:激发波长为360 nm,收集波长的范围为520-700 nm,数据导出后用Origin 8.0作图软件进行数据处理。
2结果与讨论
2.1实验原理和DNA探针设计
本方法是利用Exo Ⅲ降解HP生成游离的Poly T,然后以此作为合成荧光Cu NPs的模板,进而非标检测Exo Ⅲ的活性。实验原理如图1所示:图中为一条单链DNA,其3'端附近的碱基(8~12个A)可与中间部分的碱基T进行互补杂交,于缓冲溶液中淬火处理,该DNA可自杂交形成发夹结构(HP,如图1所示)。而HP 5'末端突出一段单链Poly T序列,但由于其碱基数目过少,不能有效合成荧光Cu NPs