- 上一篇：耐高温产酯酶芽孢菌的筛选及产酯酶条件与酶学特性研究
- 下一篇：江苏省植物性农产品中放射性调查
1.3 博来霉素抗性基因
博来霉素（Bleomycin ），是从轮枝链霉菌（Str.Verticillus）提取的抗生素。博来霉素与铁的复合物可以嵌入DNA，引起DNA单链和双链的断裂，但它不会引起RNA链断裂。引起DNA断裂作用的第一步是它的二噻唑环嵌入DNA的G-C碱基对之间，同时末端的三肽氨基酸的正电荷和DNA的磷酸基作用，使其解链。第二步是它与铁的复合物导致超氧或羟自由基的生成，引起DNA链断裂，从而阻断细胞周期的G2期，在细胞的同步培养中起诱导作用，有时候还可用于抗癌药物中。
质粒pDGICZ中含有一段大约440bp的基因片段，该片段被称为博来霉素抗性基因（ble）[14]。将该片段重组到大肠杆菌的DNA上，可使大肠杆菌在含有博来霉素的培养基上生长。常在目的菌体的基因上加入ble基因以便于后续对菌的筛选。ble的基因序列如下：
CTTGATATGGCTTTTTATATGTGTTACTCTACATACAGAAAGGAGGAACTAAATATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGAGGATCC
1.4 本课题的研究目的及应用前景
在卵巢癌的临床治疗中，必须要解决的一大问题就是病变细胞耐药性的问题[22]。现已发现卵巢癌的病变细胞之所以具有较强的抗药性，是因为细胞内一种叫做PDI（Protein Disulfide Isomerase，蛋白质二硫键异构酶）的酶的表达水平很高，并已通过化学合成的方法合成出了一种活性化合物作为抗PDI因子。而目前抗PDI因子的检测方法主要是通过单纯的酶法检测，虽然该检测方法简单易操作，但是由于是在非生理环境下，所以检测结果是否适用于生物环境还未可知。本课题采用基因敲除、基因置换和构建报告基因等一系列技术手段来构建抗PDI因子（Anti-PDI Factor）的生物检测系统，最终通过细菌报告基因的表达来指示待测物质的抗PDI活性。应用该系统能够靶向性地筛选出抗PDI因子，制备恢复卵巢癌药敏性的口服小分子辅助药物。
2.实验
2.1 实验目的
卵巢癌是目前妇科恶性肿瘤中死亡率最高的疾病,约70%的患者在后期才被诊断出来,导致治疗效果不佳[15]。现已发现各种人类癌症，包括卵巢癌中，一种名为PDI（蛋白质二硫键异构酶）的表达水平增加[16]。因此，安全有效并具有选择性的小分子PDI抑制剂是现在卵巢癌治疗的重要途径。
本毕业设计是在已完成抗PDI因子生物检测系统构建的前两步，即抗PDI因子的化学合成和大肠杆菌与人体中PDI相对应的dsbA基因的敲除的前提下继续进行的，主要涉及目的基因hPDI的获取以及抗性基因ble的插入并构建重组菌体JCB816-ΔdsbA-hPDI。所以通过本毕业设计主要需达到以下目的：培养实验操作者的基本实验操作能力，熟练掌握RNA的提取、逆转录、质粒的提取、PCR、凝胶电泳和细胞转化等实验操作，在已成功合成抗PDI因子并成功敲除大肠杆菌的dsbA基因的前提下，完成目的基因hPDI的获取以及抗性基因ble的插入并构建重组菌体JCB816-ΔdsbA-hPDI，为之后用药打下坚实基础。
2.2 实验原理
本毕业设计在前期已通过基因敲除等手段完成了抗PDI因子的化学合成和大肠杆菌与人体中PDI相对应的dsbA基因敲除的前提下，采用构建报告基因和基因置换等一系列技术手段来继续构建抗PDI因子（Anti-PDI Factor，简称APF）的生物检测系统，最终通过细菌报告基因表达来指示待测物质的抗PDI活性。
首先，提取肾小管上皮细胞的RNA，通过逆转录、PCR得到hPDI基因。接着通过酶切酶连将抗性基因ble与hPDI基因连接起来，并构建重组菌体JCB816-ΔdsbA-hPDI。在实验过程中，最重要的是PCR中引物和退火温度的探索。引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性主要取决于模板DNA与引物互补的程度。一般情况下，只要知道一段模板DNA序列，就能按照这个序列设计互补的寡核苷酸链作为引物，PCR就可将模板DNA的特定序列在体外大量扩增。同时退火温度也是关系到PCR特异性的重要因素。模板DNA变性后将温度快速冷却至40℃—60℃，能够使模板和引物发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，所以模板和引物之间碰撞结合的机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，主要取决于引物的长度、碱基的组成及其浓度，还有目标序列的长度等因素。