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        3.70摄氏度温育3分钟(若温浴时间过长则可能损害RNA)。
        4.室温12000一14000g离心10分钟
        5.用移液枪将澄清的裂解液转入一新离心管中,注意避免碰到沉淀。
        6.加入200微升95%乙醇,用移液枪吸打使其混匀。将此混合液转移至离心柱配装体中,室温12000一14000g离心l分钟。
        7.从离心柱配装体上取下离心柱,抛弃收集管中的液体。将离心柱放回收集管内。加入600微升RNA Wash Solution用以洗涤RNA,室温12000一14000g离心l分钟。
        8.重复一次步骤7。
        9.配制Dnase I孵育混合物,每个RNA样品需40微升Yellow Core Buffer, 5微升,0.09M  MnC12和5微升DNase I,用移液枪轻轻吸打混匀(不要震荡)。(DNase I必须在冰上解冻,用移液枪轻轻混匀)。
        10.将50微升刚配制的DNase孵育混合物打到离心柱内的膜上,注意不要碰到膜同时要让溶液与膜接触并完全覆盖膜。
        11.室温下温育1 分钟。然后向离心柱中加入200微升DNase Stop Solution,室温12000一14000g离心1分钟。
        12.加入600微升RNA Wash Solution,室温12000-14000g离心1 分钟。
        13.抛弃收集管内液体,向离心柱加入250微升 RNA Wash Solution,高速离心2分钟。
        14.将离心柱从收集管转移到1.5m1带盖洗脱管上,向离心柱内的膜上加30微升RNase-free水,室温12000 -14000g离心1分钟,抛弃离心柱,盖好盛有RNA样品的洗脱管,置于-700C贮存备用。
        提取的总RNA样品完整性、浓度及纯度的检测方法同第一章1.3.1。
    1.4 cDNA的合成
    1.4.1用于基因片段验证的cDNA合成
        用PrimeScript RT Master Mix ( Perfect Real Time ) 快速反转录试剂盒进行cDNA的合成。具体操作步骤如下:
        1.在没有RNA酶的离心管中配置反应液(应在冰上进行):
         总RNA                            <8μL(500ng)
         5xPrimeScript RT Master Mix       2μL
            RNase Free dH20                   up to 10μL

        2.反应条件如下:
            37摄氏度,15分钟;;85摄氏度, 5秒;4摄氏度保温
            合成的cDNA样品置于-20摄氏度保存备用。

    1.4.2用于RACE的第一链cDNA合成
        利用SMARTerTM  RACE  cDNA  Amplification Kit进行5'-RACE cDNA和3'-RACE
    cDNA的合成,具体操作步骤如下:
        1.对于每10μL体系的cDNA合成反应,首先配制Buffer Mix,体系如下:
           5xFirst-strand Buffer            2μL
           DTT ( 20 mM )                    1μL
           dNTP Mix(10 mM)                  1μL        
           总体积                           4μL
        2.在两个离心管中分别混合以下试剂:
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