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    1.1.1 菌株、质粒和试剂
    灵芝(Ganoderma lucidum HG)菌株G20来自上海农科院,大肠杆菌DH5α储存于本实验室。质粒pMD18-T vector购自大连Takara公司。溶壁酶购自广东省微生物研究所。Taq DNA polymerase、T4 DNA ligase、M-MLV反转录酶、RNAiso plus提取剂等均购自大连Takara公司。SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、所有抗生素均购自上海生工生物工程公司。其它化学试剂均来自Sigma公司或为国产分析纯。
    1.1.2 菌株培养
    1.1.2.1 大肠杆菌DH5α的培养
    大肠杆菌DH5α于LB培养基在37℃下培养,-70℃保存。LB培养基配方见附录。
    1.1.2.2 灵芝菌株G20的培养
    灵芝菌株于PDA培养基或CYM培养基在28℃下培养,菌种接于PDA固体斜面培养基4℃保存。PDA培养基和CYM培养基配方见附录。
    1.1.3 主要仪器
    ABI 2720型PCR仪,Eppendorf realplex2荧光定量PCR仪,Eppendorf Centrifuge 5417R型台式低温高速离心机,DYY-10C型电泳仪,DYCZ-20B型电泳槽,凝胶电泳成像仪,EclipseTi-S光学显微镜,7231型分光光度计,组织粉碎机,28℃恒温培养箱,冰箱,超低温冰箱,超净工作台,水浴锅。
    1.2 实验方法
    1.2.1灵芝bZIP家族转录因子的系统性筛选
    通过blast软件将部分真菌bZIP家族转录因子与灵芝全基因组本地数据库进行blastP分析;将初步筛选的结果(E值<10-5)与NCBI网站上的非冗余蛋白数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行反向blastP,进一步确认筛选序列与bZIP家族的同源性。
    1.2.2 灵芝bZIP家族转录因子基因的生物信息学分析
    通过一些生物学软件和在线网站,对灵芝bZIP转录因子进行了一系列研究相关的生物信息学分析。
    通过NCBI网站blast功能(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对蛋白质序列进行相似性比对;利用网站(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)对bZIP家族蛋白质进行分子量及等电点预测;对灵芝bZIP家族转录因子蛋白质序列的功能域分析通过网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)实现;通过网站(http://linux1.softberry.com/)对灵芝bZIP转录因子进行亚细胞定位预测;使用MEGA6.0软件对相关序列进行聚类分析,并生成系统进化树。灵芝基因组数据来自网站(http://genome.jgi.doe.gov/cgi-bin/metapathw
    ays?db=Gansp1)。用于初步比对筛选的酿酒酵母bZIP转录因子蛋白序列来自酵母基因数据库(http://www.yeastgenome.org/)。灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)和褐腐菌(Postia placenta)的bZIP转录因子序列来自真菌转录因子数据库(ftfd.snu.ac.kr/index.php?a=view)。
    1.2.3 灵芝bZIP家族转录因子沉默质粒的构建
    1.2.3.1 灵芝bZIP家族基因沉默片段的PCR扩增
    运用软件Primer 5设计灵芝bZIP家族基因沉默引物GlbZIP-KpnI-F和GlbZIP-SpeI-R,并以灵芝bZIP基因cDNA为模板扩增灵芝bZIP家族基因沉默片段。
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