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蛾蝇抗菌肽Attacin-mf的基因克隆及其表达载体的构建摘要：昆虫抗菌肽是是一类广泛存在于昆虫体内的小肽类物质，它是机体先天性免疫系统的重要组成部分，也是一种分子量小、热稳定性强、水溶性好、无免疫原性、强碱性、抗菌谱广的新型抗菌药物。到目前为止，蛾蝇来源的抗菌肽没有被报导确认过。在本实验室的前期工作中，我们对蛾蝇转录组进行分析时发现其具有attacin抗菌肽序列。在本研究中，我们拟以蛾蝇成虫提取的总RNA为原料，以attacin序列为模板设计上下游引物，通过PCR得到完整的双链cDNA并将其克隆到PMD19-T载体上，将连接产物导入大肠杆菌DE-3后进行抗生素筛选，对生长的菌落进行菌落PCR鉴定。实际工作中，我们成功构建了克隆载体，表达载体由于由于遇到困难暂时无法构建。本实验并未涉及蛾蝇attacin抗菌肽基因的诱导表达，但为进一步研究蛾蝇attacin抗菌肽的调控机制与功能提供了实验基础。26204
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毕业论文关键词：蛾蝇；抗菌肽；基因克隆；克隆载体
Cloning of the Antibacterial Peptide Attacin Gene from Moth Fly and the Construction of Its Expression Vector
Abstract: Insect antimicrobial peptides are a kind of small peptides widely found in insects. It is an important part of the innate immune system. They are peptides of small molecular weight, strong heat stability, good solubility, no immunogenicity, strong alkaline, broad antibacterial spectrum active. So far, the moth-derived antimicrobial peptides have not been reported. In the preliminary work of this laboratory, we analyzed the moth flies and found that it had the attacin antimicrobial peptide sequence. In this study, we intend to use the total RNA extracted from the adult larvae of Moth, as the raw material, and use the attacin sequence as the template to design the upstream and downstream primers. The complete double-stranded cDNA was obtained by PCR and cloned into the PMD19-T vector. After the introduction of E. coli DE-3 antibiotic screening, the growth of colonies were identified by colony PCR. In the actual work, we successfully constructed the cloning vector, the expression vector due to difficulties encountered temporarily unable to build. In this study, we did not address the induced expression of the attacin antimicrobial peptide gene, but provided the experimental basis for the further study on the mechanism and function of the attacin antimicrobial peptides in moth fly.
Key words: moth flies; antimicrobial peptides; gene cloning; cloning vector
引言
抗生素的发现与应用，为人类治疗病原菌感染性疾病提供了保障。但是近年来，由于抗生素的广泛滥用，很多致病菌已经开始出现耐药性，甚至出现了一些超级耐药菌，这对人类健康带来了巨大的威胁。寻找和开发新型抗微生物药物已经成为医学界迫在眉睫的难题。自然界的生物体随时随地都面临着微生物的挑战，它们发展出了一套有效的机制以抵御微生物病原体的侵袭。脊椎动物拥有先天免疫系统和后天性免疫系统两种方式来杀灭外界微生物，但无脊椎动物缺乏后天免疫系统，只能依靠先天免疫系统来抵御外界微生物。抗菌肽作为先天免疫系统中的一环，担负了极其重要的功能，尤其是对于没有后天免疫系统的无脊椎动物和后天免疫系统脆弱的低等脊椎动物，必须依靠主要由抗菌肽组成的先天免疫系统来抵御病原微生物的感染［1］。抗菌肽是一种阳离子宿主防御肽（Cationic host-defense peptides），由前体肽经过一个或多个水解活化步骤并基因编码得到。由基因编码、核糖体合成的抗菌肽是宿主先天性免疫防御系统产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽类生物活性物质，是先天性免疫的重要效应分子。天然抗菌肽通常很短（10~50个氨基酸），整个分子带正电（通常为+2到+9），富含赖氨酸、精氨酸和组氨酸等碱性氨基酸，并有相当一部分（≥30%）的疏水残基，等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。抗菌肽一般都有两亲性结构，有1个疏水区域与脂质结合，1个带正电荷的亲水性区域与水或者带负电荷的残基结合。这些特性使得抗菌肽能够很好地与由两性分子构成、特别是呈电负性的细胞膜结合，这是抗菌肽与细菌细胞膜发生相互作用的结构基础。折叠多肽大致分为四种结构：（1）由2~4个二硫键固定的β-折叠多肽（如：human α-和β-defensins，plectasin，protegrins）；（2）α-螺旋多肽（如：IL-37，cecropins，magainins）；（3）分子结构中含有大量特殊氨基酸（如甘氨酸、脯氨酸、色氨酸、精氨酸和/或组氨酸）的多肽（如：indolicidin）；（4）环形多肽（如：bactenecin），包括头尾封闭的环形抗菌肽和头尾不封闭，但是分子结构中存在二硫键的环形抗菌肽。大多数抗菌肽具有热稳定性，在100 ℃条件下加热10~15 min仍能保持其活性。研究表明，部分抗菌肽的抗菌作用和溶液中的Na+浓度存在负相关性，当 NaCl浓度为150 mmol/L时即失去活性。许多因素会降低抗菌肽的活性，如高浓度的一价和二价阳离子、聚阴离子 ( polyanion)、 血清、阿朴脂蛋白A-Ⅰ（apolipoproteinA-Ⅰ）和蛋白酶等［2］。然而，有些抗菌肽对较大的离子强度和较低或较高的pH都具有较强的抗性，部分抗菌肽具有抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。此外，抗菌肽还具有水溶性好、不产生耐药性等优点。