1 材料与方法 (仿宋体四号)
1.1 实验材料
本研究采用的实验材料是玉米抗茎腐病菌品种“吉单180”。玉米侵染菌种为禾谷镰刀菌(Fursarium graminearum)。在25℃条件下,通过盆栽,营养液水培,在幼苗成长至一月大小时,采用禾谷镰刀菌(Fursarium graminearum)对其茎部针刺注射悬浮液,进行侵染,侵染过程中禾谷镰刀菌接种量保持一致,同时取另一组施加KCl,KCl的浓度为5mM,当侵染7天时,分别取接种侵染的和接种侵染加KCl的玉米茎部作为实验侵染组样品,同时取正常生长(非侵染)实验为对照组样品,实验设两次重复,取材后立即放入液氮速冻,然后转入超低温度冰箱保存,待蛋白质组学分析用。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 主要仪器
冷冻离心机 (Eppendorf)、ImageScanner扫描仪(GE Healthcare)、真空冷冻干燥机(Thermo savant)、Eksigent nanoLC-Ultra™ 2D系统(AB SCIEX)、分析型液相色谱Agilent 1200(Agilent)、Q Exactive 质谱仪(Thermo Scientific)、超声波细胞粉碎仪、水浴锅、天平、紫外分光光度计、Eppendorf 冷冻离心机 (Eppendorf)、涡旋振荡器、水浴锅、恒温孵浴器。
1. 2. 2 主要试剂
尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、二硫苏糖醇(Dithiothreitol, DTT)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、碘乙酰胺(Iodacetamide, IAA)、IPG Buffer、甲酸(Formic acid)、甲酸铵购自GE公司;十二烷基磺酸钠(SDS)、三羧基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、三氯乙酸(Trichloroacetic acid, TCA)、 过硫酸铵(Ammonium persulfate, APS)、 碳酸钠、N,N,N',N'-四甲基二乙胺(TEMED)均购自Amresco公司;蛋白酶抑制剂(PMSF)购自Sigma公司;胰蛋白酶(Trypsin Gold)购自Promega公司、乙腈(Acetonitrile, CAN)、色谱水等购自Thermo fish;iTRAQ 8 plex 试剂盒 (AB SCIEX)、Tris-HCl(pH 6.8、 pH 8.5、 pH 8.8)、考马斯亮蓝G-250、溴酚蓝(Bromophenol blue)、 丙酮、甲醇、乙醇、NH₃•H₂O 、蛋白浓度测定试剂盒。其它试剂均为国产分析纯。
1. 2. 3 玉米幼苗茎部总蛋白质提取
(1)称取0.5 g样品与预冷的研钵中,加入液氮研磨粉碎(研磨过程中加入适量PVP);
(2)将磨好的样品放入50 mL离心管中,加入-20℃预冷的10% TCA-丙酮溶液(含0.1% DTT和1 mM PMSF),-20℃静置2 h;
(3)4 ℃,12000 rpm/min,离心20 min,弃上清;
(4)在沉淀物中加入-20 ℃预冷的丙酮溶液(含0.1% DTT和1 mM PMSF),用玻璃棒将沉淀捣碎,-20℃静置1 h。静置过程中涡旋一次;
(5)4℃,12000 rpm/min,离心20 min,弃上清;
(6)重复(4)(5)步骤,根蛋白一次,叶片蛋白两次;
(7)用滤纸封住管口,将沉淀物放入冷冻真空干燥机中干燥20分钟;
(8)将干燥的蛋白粉末至于-40℃冰箱中保存备用。
1. 2. 4 总蛋白酶解
(1)根据蛋白定量结果取100 μg蛋白样品加入到1.5 mL的离心管中,定容至30 μL,并做好标记。
(2)向每管样品中加入4倍体积(120 μL)的还原剂,充分涡旋混匀,短时离心将粘在管壁上的蛋白溶液离到管底,然后37℃水浴1 h。
(3)加入与还原剂等体积(120 μL)的烷基化试剂,涡旋混匀,室温避光放置10~15 min。
(4)取新的超滤管(10kD),然后将还原烷基化后的样品转移至对至对应的超滤管中,4℃,12000g,40 min,将未反应液体全部离心下去。
(5)向每个超滤管中加入50 μL 的TEAB1,4℃,12000g,30min,直至超滤管中的液体全部离心下去。
(6)取出超滤管,弃掉收集管底部溶液,然后向每管中加入150 μL的Buffer ,4℃,12000g,40 min。
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