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（7）向每个超滤管中加入150 μL的TEAB1，4℃，12000g，40min。
（8）取出超滤管，弃掉收集管底部溶液，重复步骤7两次。
（9）取出超滤管，弃掉收集管底部溶液，加入400 μL 色谱纯水，使用移液器反复冲洗超滤管，弃掉洗液。
（10）向每管中加入100 μL配制好的酶解液，37℃水浴过夜或14h～16h。
1. 2. 5 iTRAQ标记反应
（1）取出冻干的样品，向其中加入100 μL TEAB2使其浓度为1 μg/μL，并充分涡旋混匀，取40 μg肽段样品于1.5mL离心管中用于标记反应，其余样品备用。
（2）iTRAQ试剂的准备:从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底。
（3）确保样品的pH 呈碱性一般为8左右，加入有机溶剂溶解iTRAQ试剂，加入的体积可以根据样品体积进行调整，保证有机溶剂终浓度为70%以上。
（4）向每管中加入200 μL异丙醇，充分涡旋混匀，离心，重复1次。
（5）取混匀离心后的iTRAQ试剂105 μL加入到含40 μL 蛋白样品的离心管中，涡旋混匀，离心，于室温下放置2 h。
（6）反应结束后向每管中加入200 μL色谱纯水。
（7）混合标记后的样品，涡旋振荡充分混匀，离心至管底。
（8）从管中抽取适量体积的样品至一个新的离心管中，冻干后以备预实验，检测标记效率及定量准确性，确认标记反应良好。
（9）使用真空冷冻干燥机抽干样品，待上机分析。
1. 3 全蛋白的质谱鉴定及差异分析
将分离得到的多肽组分送入LC-MS/MS质谱仪进行分析。质谱采集参数：正离子反射模式，一级质谱分子量范围为700-4000 Da，二级质谱分子量范围为40-1050 Da。MASCOT软件搜库参数设置如下：Enzyme：Trypsin；最大允许错切位点：1；Fixed modifications：carbamidomethylation；Variable modifications：oxidized；一级质谱容差：150ppm；二级质谱容差：0.5 Da；P值≤0.05。最终以MASCOT软件评估为阳性结果的蛋白视为蛋白鉴定成功。差异表达蛋白确定根据两次重复均大于1.5倍或小于0.67倍为标准，同时P值小于0.05水平。