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摘要： 【目的】 通过 qRT-PCR 方法明确候选基因 Glyma.03g035300 是否受疫霉菌株 HeN08-35 的诱导并克隆该基因的CDS 序列，为最终抗性基因的功能分析打下基础。【方法】 本研究在利用蒙8026和临蒙 6-46 衍生的 F2:3家系精细定位的基础上，在其候选区域选了一个可能与抗病相关的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶进行研究，利用qRT-PCR 技术分析了大豆抗病品种蒙8206和感病品种临蒙 6-46 在接种疫霉菌株HeN08-35后的转录水平，确定该基因是否受大豆疫霉菌的诱导。参考Willimas 82中该基因的转录序列，在其 5’UTR 和 3’UTR 区域设计引物克隆候选基因 Glyma.03g035300 的 CDS 序列。【结果】 抗性候选基因 Glyma.03g035300 是受疫霉诱导，并成功克隆了该基因的CDS序列。 27432
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毕业论文关键词：大豆疫霉根腐病；抗性候选基因；qRT-PCR 分析；CDS克隆
Cloning and qRT-PCR Analysis of Resistance Candidate Gene Glyma.03g035300 to Phytophthora sojae in Soybean Abstract： 【Objective】 Glyma.03g035300，one of defense-candidate genes, was analyzed inducing situation to P. sojae HeN08-35 using qRT-PCR method. And CDS sequence of the gene was cloned. These research laid foundation to cloning and function analysis of resistance gene.【Method】 In previous study, The resistance locus from Meng8206 has detected using F2:3 family derived from Meng8206 and Linmeng6-46. We choose a serine/ threonine protein kinase gene that may be related to the resistance to Phytophthora root rot of Soybean in the fine mapping region. The transcriptional level of Glyma.03g035300 in Meng8206 and Linmeng6-46 were studied after inoculation P. sojae HeN08-35 to definite induced situation of the gene. The CDS sequence of the gene was cloned and primers were designed referring to 5’UTR 和3’UTR sequence of willimas 82.【Result】 The resistance candidate gene Glyma.03g035300 was induced by P. sojae HeN08-35 and has been cloned. Key words: Phytophthora sojae；serine/ threonine protein kinase；qRT-PCR analysis；gene cloning
目 录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1．1 供试材料 2
1．2 培养基的制备 2
1．3 接种和取样方法 2
1．4 候选基因的筛选3
1．5 总 RNA 的提取3
1．6 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析3
1．6．1 引物设计3
1．6．2 cDNA 第一链的合成3
1．6．3 实时荧光定量 PCR 4
1．7 Glyma.03g035300 基因 CDS 序列的扩增 4
1．8 PCR 产物的回收、T 载体连接及转化5
1．8．1 PCR 产物的回收5
1．8．2 T 载体的连接5
1．8．3 转化5
1．9 克隆质粒的鉴定、提取、测序5
2 结果与分析6
2．1 总 RNA 的提取6
2．2 实时荧光定量 PCR 结果6
2．3 CDS 序列的克隆6
2．4 阳性克隆的筛选7
2．5 阳性克隆的测序7
3 讨论与展望9
致谢10
参考文献11
引言 【研究意义】大豆疫霉根腐病（Phytophthora root rot of Soybean, PRR）是由土传卵菌大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufmann & Gerdemann, P. sojae）引起的毁灭性的大豆病害之一。 1948年于美国印第安纳州首次发现大豆疫霉根腐病并且成功分离出大豆疫霉菌，迄今为止该病已遍布美洲、欧洲、大洋洲、亚洲的大豆主产区，成为了世界性的大豆病害。大豆疫霉根腐病严重危害到了大豆的生产，可致减产 10%~60%，严重时甚至可导致绝产[1]。大豆疫霉根腐病可以通过检验检疫、栽培管理、种子处理、利用抗耐病品种等方法进行防治，但是最环保、经济、有效的方法就是利用抗耐病品种。大豆疫霉菌变异非常快，其生理小种更新迅速，大豆的抗病性平均有效期仅为 8~10 年，因而需要不断的挖掘新的抗大豆根腐疫霉病基因[2]。【前人研究进展】目前已鉴定出了至少 32个Rps 基因，分别分布在大豆的 N、J、F、G、D2、L、O、D1b，共 8个连锁群上[3-5]，但是这些抗病基因尚未进行充分的功能鉴定，关于抗病基因图位克隆的报道也很少。研究表明通过对抗性基因进行克隆有助于了解作物的抗病分子机理，目前这一方法在水稻的抗病性研究中广泛运用[6]。陈锦文等利用RT-PCR 方法分析得到了唯一的抗稻瘟病候选基因 Piy43-3，后期采用分段克隆测序策略，在云引中发现了含完好的抗稻瘟病基因 Pib[7]。王琦等对抗水稻条纹叶枯病基因 STV11进行图位克隆，证明抗病亲本材料对水稻条纹病毒显示出特异性抗性,而且抗病亲本能够在细胞水平上抑制水稻条纹病毒的复制 [8]。据报道，蛋白激酶在植物抗病信号传递中有着十分重要的作用[9]，已有学者利用蛋白激酶在感病和抗病品种中的表达差异来验证候选基因是否具有抗性。陈艳林等利用qRT-PCR 方法分析了超量表达 StLRPK1 本氏烟草株系接种前后 PTI marker 基因的表达， 探索类受体激酶基因 StLRPK1 介导的可能的抗病信号传递途径，证实了含StLRPK1 基因的马铃薯对晚疫病的抗性得到了增强[10]。抗病候选基因的鉴定是获得最终抗病基因的关键步骤，目前在分子植物育种上多利用生物信息学和 qRT-PCR 分析鉴定抗病的候选基因。谢小芳等在对细条病抗性 QTL qBlsr5a 进行精细定位的基础上，对定位区间进行了生物信息学分析，最后筛出了10个与抗病相关联的注释基因。应用 qRT-PCR 技术对接种细条病菌后的该 10 个基因进行分析，最终获得了该 QTL 的一个关键候选基因qBlsr5a[11]。【本研究切入点】目前为止已经定位到了一些与疫霉根腐病抗性相关的基因，但关于抗性基因的图位克隆报道很少。对抗病基因进行鉴定以及分离是研究基因功能的关键，在对大豆抗疫霉根腐病的研究中有重要意义。【拟解决的关键问题】本研究在利用蒙 8026 和临蒙 6-46 衍生的 F2:3家系精细定位的基础上，在该定位区间的候选区域内找到了一个丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，利用 qRT-PCR 技术比较了大豆抗病品种蒙 8206和感病品种临蒙6-46 接种疫霉菌株HeN08-35 后的转录水平，进一步确定该基因是否受疫霉诱导。进而利用 Willimas 82 的序列为参考，设计引物克隆其 CDS 序列，为最终克隆抗性基因和研究基因功能打下基础。 1 材料与方法 1．1 供试材料 本次实验用到的大豆材料为抗病品种蒙 8206 以及感病品种临蒙 6-46；接种的疫霉菌为HeN08-35（毒力公式为 3a, 3c, 4, 5, 6, 7），由南京农业大学植物保护学院提供，疫霉菌株在 V8 斜面培养基上保存备用、后期转移到新的 V8 平板培养基上进行活化和扩繁。 1．2 培养基的制备 V8番茄汁平板（斜面）培养基及 LB培养基的配方如下： LB 液体培养基：溶液 PH值为7，5g酵母提取物，10g NaCL，10g 胰蛋白胨，加蒸馏水至1000ml。配置固体培养基需加入 10%琼脂糖。 V8番茄汁平板（斜面）培养基：0.02%CaCO3，10%Campbell's V8 番茄汁，1.5%琼脂粉。 1．3 接种和取样方法 大豆抗病品种蒙 8206和感病品种临蒙6-46在温室内种植培育一周左右，待两片真叶长出并完全展开时，采用下胚轴创伤接种法接种含疫霉菌 HeN08-35 的琼脂块，在子叶节下方轻划1cm 的伤口，将琼脂块含有菌丝的一面与伤口贴合。分别在接种后的0h、12h、36h、48h和72h 取样并用液氮速冻，然后保存在-80℃冰箱中以备提取RNA。 1．4 候选基因的筛选 在蒙 8026 和临蒙 6-46 衍生的 F2:3家系精细定位的基础上，参考已经公布的大豆品种Williams82 数据库的信息(http://www.phytozome.net/soybean)，根据基因注释，寻找具有典型抗性基因结构特征或者与已知抗性基因具有较高同源性或者曾经报道过参加植物抗病性反应的基因，这些基因成为抗病基因的候选基因。 1．5 总 RNA的提取 提取大豆叶片总 RNA时用专用的灭菌过的枪头、Eppendorf管，研钵、研棒等也要用无水酒精在小托盘中灼烧 30 min，保证全部相关用具灭菌干净。提取办法参考试剂盒步骤说明，第一次使用前需要在漂洗液 RW、去蛋白液 RD 中加入一定量的无水乙醇，加入量可参考瓶上标签。具体操作步骤如下： （1）样品处理：将取样后保存于-80℃冰箱中的叶片置于液氮中快速磨碎。每 50~100mg组织需加入 1ml 裂解液 RZ，然后利用匀架仪进行匀浆处理。样品的体积不可大于裂解液RZ体积的1/10。 （2）将匀浆后的样品于15~30℃中放置5min，可完全分离核酸蛋白复合物。 （3）可选步骤：若样品中仍存在较多的蛋白质、脂肪、肌肉或者多糖、植株结节部分等杂质，可将样品4℃12,000rpm（~13,400× g）离心 5min，离心后的沉淀包括细胞多糖、外模、高分子DNA，上清液则为RNA。取上清液，转移到一个新的无 RNase的离心管中。 （4）往 RNA 样品中加入 200µl 氯仿，盖紧管盖，上下剧烈震荡 16s，然后于室温静置3min。 （5）4℃12,000rpm（~13,400× g）离心 10min，样品被分为三层：黄色为有机相，无色为水相和一个中间层。RNA主要存在于水相中，水相的体积约为所用裂解液 RZ体积的1/2；将水相移到新的离心管中再进行下步操作。 （6）缓慢加入 1/2 体积的无水乙醇，混匀（此时有可能出现沉淀）。将沉淀和溶液一起转入吸附柱 CR3 中，4℃12,000rpm（~13,400× g）离心 30s，若吸附柱 CR3 一次不能装完溶液和混合物，可分两次转入吸附柱 CR3，4℃12,000rpm（~13,400× g）离心 30s，弃去收集管中的废液。 （7）往吸附柱CR3 中加入500µl 去蛋白液RD（使用前需查看是否已经加入乙醇），4℃12,000rpm（~13,400× g）离心30s，弃掉废液。 （8）往吸附柱CR3 中加入700µl 漂洗液RW（使用前需查看是否已经加入乙醇），室温静置2min，4℃12,000rpm（~13,400× g）离心 30s，弃掉废液。 （9） 往吸附柱CR3 中加入 500µl 漂洗液RW，室温静置 2min， 4℃12,000rpm （~13,400× g）离心30s，去除残余液体。 （10）将吸附柱放入 2ml 收集管中，4℃12,000rpm（~13,400× g）离心 2min，去除残余液体。 （11）将吸附柱CR3 转到一个新的离心管，加入 30µl RNase Free ddH2O，室温放置2min，4℃12,000rpm（~13,400× g）离心2min。 1．6 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析 1． 6． 1 引物设计 参考willimas82的CDS 中一段特异性序列，用 Primer Premier5.0软件设计特异引物。