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图 1 低氮素(LN)条件下与正常氮素(NN)条件下的株高比(RPH)、 有效穗数(RPN)频数分8
图 2 敏感和不敏感家系在两个氮素水平下表型图,比例尺代表 10cm9
图 3 SNP 标记在水稻染色体上的分布图及数目和 QTL 的分布9
表 1 普野与 9311 群体氮素利用性状相关描述性统计8
表 2 普野与 9311 群体氮素利用性状相关性分析8
表 3 两种性状的 QTL 检测结果10
1 引言1.1 氮素在植物体内生长发育的作用1.1.1 植物中的氮源 氮元素是植物从土壤中可以定量获取的最重要营养元素。植物通过其发达的根系从土壤中吸收并利用低分子态的氮化合物如铵态氮、硝态氮和氨基酸。空气中的氮气(N2)含量达到了 79%,然而,植物却无法直接利用这些分子态氮。只有一部分微生物(其中包括与高等植物共生的固氮微生物)才能利用空气中的氮气，所以植物体可以利用的氮源,主要来自土壤。土壤中来源于动物、植物和微生物躯体的腐烂分解的有机含氮化合物的溶解度大多是很低的,因而通常不能直接被植物体利用， 植物只可以吸收其中部分氨基酸、酰胺和尿素等水溶性的有机氮化物。植物体内的氮主要来源于无机氮化物,其中又以铵盐和硝酸盐为主,它们大约占土壤含氮量的 1-2%。植物体从土壤中吸收铵盐后,可以直接利用它们去合成氨基酸。如果吸收硝酸盐,那么必须经过一系列的代谢还原(metabolic reduction)才能被植物体利用,因为蛋白质的氮是呈高度还原态的,而硝酸盐的氮则是呈高度氧化态的。[1]1.1.2 氮素在植物体内的营养功能 氮元素是植物体内重要的大量营养元素，植物对氮素的吸收多少很大程度上限制了作物生长的产量形成[2]。 氮是植物体细胞原生质中的基本物质，同时植物体内每个活细胞中都含有大量的氮。与此同时，氮也是绿色植物制造叶绿素的重要物质，它能够促进植物生长，使植物的叶色变得更加浓绿。氮元素还参与了植物体内蛋白质和核酸的合成，也就在一定程度上促进了植物的生长和发育，使植物绿色枝叶的叶面积逐渐增大。蛋白质是一个细胞文持生命特征所必须的物质，其平均含氮量为 16%~18%，在植物体的生长发育过程中，蛋白质参与了生长和细胞分裂的过程。当植物体缺氮时新细胞形成受阻，植物生长发育缓慢，严重缺氮时则会出现生长停滞等一系列状况。因此氮元素是所有有机生命体所必需的生长元素，它也被称为生命元素。核酸和核蛋白在植物体的遗传变异过程中有特殊的作用，它们是蛋白质合成的模板，与此同时它又承担了传递决定作物遗传信息的功能。而氮元素在核酸中的含量为大约为15%，当作物生长过程中所摄入的氮含量过低时，作物的生长发育和生命活动会受到严重影响。绿色植物有赖于叶绿素进行光合作用，叶绿素的多少将会直接影响作物光合作用的速率和光合产物的形成。当植物缺氮时，植株体内的叶绿素含量下降，叶片变黄，光合作用强度减弱，光合产物相对应的也会减少，这也就使得作物产量明显降低。绿色植物生长和发育过程中假如没有氮素的参与是不可想象的。1.2 植物氮素的吸收和利用机制 不同的植物有两种不同的氮素获得途径，一种途径是植物的根部与固氮微生物形成共生关系，产生根瘤，通过根瘤固定大气中丰富的氮作为植物的氮素营养来源，这种方式主要出现在多数豆科植物和少数十字花科植物中；另一条途径是植物通过根表皮上的根毛细胞从土壤中 NH4+和 NO3-等矿质离子，这是包括水稻在内的绝大部分植物获取氮素营养的主要方式，这一方属于需要消耗代谢能的主动吸收过程[4]。植物从土壤中吸收氮素的主要形式有硝态氮、铵态氮和氨基酸态氮。某些可溶性含氮有机化合物（如各种氨基酸、酸胺和尿素等），但通常可供水稻吸收的有机氮和亚硝态氮并不多[5]。植物吸收 NH4+和 NO3-均是主动运输的过程,NO3-被植物根吸收后,小部分在植物根中直接被同化,大部分被转运到地上部,转运到地上部的 NO3-进一步被还原成 NO2-和NH4+,最终被同化为植物可直接吸收的部分。 NH4+进入植物体后,很少以NH4+的形式向上运输,而是快速同化为氨基酸后运往地上部;当植物体内碳水化合物含量高时,可促进NH4+的吸收。1.3 水稻氮素利用相关研究进展 高等植物对铵态氮的吸收主要通过铵转运蛋白(ammonium transporters, AMTs). 在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, 铵转运蛋白分为AMT1 和 AMT2两类, 分别包括 5 个和 1 个成员. AtAMT1;1 在根中和地 上 部 分均 有 表 达 , Km 值 小 于 0.5 µmol/L, 而 AtAMT1;2 和 AtAMT1;3 主要在根中表达, Km 值均接近 40 µmol/L[6]。近年来也有一定数量的硝酸盐转运子基因被报道。可以将这些基因分为两个序列特异的硝酸盐转运家族,NRT1和 NRT2。这些硝酸盐的浓度状况并被内源信号如氮代谢和基叶对氮的需求所调控。研究表明 NRT2转运子为硝酸盐诱导型、高亲和力吸收系统,而 NRT1转运子具备诱导型和组成型表达能力,对氮的吸收也更广泛[7]。水稻中硝酸盐转运蛋白功能研究还不多, 通过与 AtNRT1.1 序列相似性分离到 OsNRT1,但 OsNRT1 在水稻中的功能尚不清楚[8]。最近研究发现 OsPTR 家族中OsPTR6具有转运二肽和三肽的能力[9]；OsPTR9 受到外界氮源和昼夜节律调控, 过表达 OsPTR9 转基因水稻表现出了更高的氮利用率和产量[10]，但仍没有证据表明其具有转运硝酸盐的能力。之前也有关于植物氮素吸收利用的一些文献综述被报道了[11-13]。1.4植物数量性状的QTL定位研究 数量性状QTL分析是基于高密度分子标记连锁图谱来解析复杂性状的遗传机理[11-13]。研究已经在玉米、小麦、拟南芥和水稻等作物中有大量的运用。采用合适的统计分析方法是有效利用基因型信息和表型信息的关键，关系到 QTL定位结果的优劣。 根据标记的使用来分， 通常分为单标记分析、 区间定位 （Intervalmapping, IM）、复合区间定位（Composite interval mapping, CIM）以及多区间定位（Multiple interval mapping, MIM） [15]。 还有完备区间作图法， 完备区间作图法(Inclusivecomposite interval mapping， ICIM)的提出是为了改善复合区间作图的缺点的一种新方法，该方法利用所有标记的信息，通过逐步回归选择重要标记变量来估计其效应，不仅能定位加/显性效应 QTL，还能定位上位型互作 QTL[16]。QTLs 定位是通过数量性状观察值与标记间的关系分析来确定各个数量性状位点在染色体上的位置、效应，甚至各个QTL 之间的相关作用。它实质上是基于一个特定的模型的遗传假设，是统计学上的一个概念。 QTL 连锁作图的构建策略一般包括：根据不同类型与规模的作图群体，选择相应合适的实验技术，采用适宜的分子标记，利用统计分析软件及数据处理软件。一般连锁作图的群体主要为： F2 群体、回交群体(BC)、单倍体加倍的群体(DH)重组自交系群体(RIL)、近等位基因系(NILs)和染色体片段置换系(CSSLs)等。1.5 文章的立论依据和意义 在目前的水稻耐低氮相关研究中，对水稻氮素吸收转运、利用的生理机制及氮高效型水稻的形态生理特性等方面有了一定的研究[17, 18]。 但氮素的吸收与利用是一个极其复杂的过程，是受多基因表达与调控的复杂性状，目前仍然有很多与之相关的基因尚未被鉴定。2 材料和方法2.1 实验材料2.1.1 实验材料来源和种植 本研究利用普通野生稻和籼稻品种 93-11为亲本构建的共计 200 个家系染色体片段置换系系群体。所有供试材料 2016 年重复种植于江苏省南京市江宁区南京农业大学水稻所土桥实验基地。 于当年 5 月 10 日左右播种，6 月 18日左右移栽，分正常氮素(Normal nitrogen)供应田与低氮素(Low nitrogen)供应田种植(土壤内含有固氮微生物)，其中低氮素供应田在 3 年内未施用氮肥，正常氮素供应田施用氮肥量为 16kg/亩，两块供应田均正常施加磷肥与钾肥(施量均为 4.5kg/亩)。 采用试验基地常规田间标准化栽培管理，每个水稻家系种植 4 行，每行 10 株，株距 16.5cm 宽行行距为 23.5cm，窄行行距为 16.5cm。 对每个家系单株进行 SNP 标记检测鉴定，确定其基因型，挑选理想单株用于进一步构建近等基因系(NIL)群体。2.1.2 材料表型数据的收集 结合水稻氮素利用效率作为研究的目的， 参照前人相关的研究报道以及具体的实验条件，主要采用以下几个指标作为氮素利用效率的考察标准：收集 200 个家系的低氮素(LN)与正常氮素(NN)条件下分蘖数(TN, tiller number)：在水稻最大分蘖期前后，选取每个家系种植小区中间长势一致 6-8 株，记录下分蘖数数值，并进行标记用于后期指标数据的收集。去除分蘖数数据中的最大值和最小值，计算出低氮素(LN)与正常氮素(NN)条件下分蘖数均值进而得出相对分蘖数(RTN, ratio oftiller number )， 即低氮素(LN)分蘖数均值与正常氮素(NN)分蘖数均值的比值。收集 200个家系的低氮素(LN)与正常氮素(NN)条件下株高(PH，plant height)：在水稻齐穗后，测量标记好的每个家系种植小区中间长势一致 6-8 株，记录下株高数值。 去除株高数据中的最大值和最小值，计算出低氮素(LN)与正常氮素(NN)条件下株高均值， 进而得出相对株高(RPH, ratio of plant height)， 即低氮素(LN)株高均值与正常氮素(NN)株高均值的比值。收集 200 个家系的低氮素(LN)与正常氮素(NN)条件下有效穗数(PN, paniclenumber)：在水稻成熟期，数取标记好的每个家系种植小区中间长势一致 6-8 株，记录下有效穗数数值。 去除有效穗数数据中的最大值和最小值，计算出低氮素(LN)与正常氮素(NN)条件下有效穗数均值， 进而得出相对有效穗数(RPN, ratio of panicle number )，即低氮素(LN)有效穗数均值与正常氮素(NN)有效穗数的比值。
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