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2.30工程菌性状稳定性与IPTG的诱导性 13
3. 实验方案、结果与分析 13
3.1实验方案 13
3.2实验结果与分析 15
3.21提取质粒 15
3.22质粒的酶切 15
3.23目的条带的割胶回收 16
3.24酶切产物的连接 17
3.25目的质粒的转化及验证 17
3.26目的质粒功能的验证 19
3.27模拟群体感应合作行为的基因回路的效果验证 19
3.28工程菌性状稳定性与IPTG诱导能力 22
4. 实验结论 23
致谢 25
参考文献 26
1. 前言
1.1微生物合作关系
微生物群体在自然界展现出令人惊奇社会行为。微生物的合作行为对于种群的进化至关重要。通过群体合作，微生物可以实现：扩散、觅食、合成生物膜、繁殖、化学战争……[1]。这些社会行为使我们对微生物有了更深刻的认识。合作行为至少给其他部分个体提供了利益。合作行为的产生主要有两种情况：
1.直接获利：双方能够直接从合作行为中获得利益。例如形成有生物膜的细菌的青紫色杆菌素会迅速增加相对于单个游离细胞，而这样能够让细菌达到相对高的密度，即使营养物质在一个很低的水平，使得菌群能方便的接收信号分子[2]；
2.间接获利：合作的一方因为与对方有着相同的祖先和亲缘性的基因，因此帮助一方繁殖有益于种群基因的传代，称这种合作方式为亲缘性选择。例如肺炎双球菌面对宿主免疫时选择部分死亡，从而使得种群延续[3];
微生物的从合作中直接获利可以从宏观生物学中得到很好解释，而间接获利把微生物的进化引入分子基因水平上，使我们对生物的进化研究进入新的阶段。
1.2微生物的利他行为
微生物的利他行为是一方劳动，而另一方获益，这看似违背达尔文进化论。Hamilton的亲缘性选择方程给予利他行为合理解释。通过帮助近亲繁殖，自身的基因仍然间接传递给下一代，从而很好解释了突变体在不同水平上的合作。
Hamilton方程：r*b-c>0，r代表合作者之间的亲缘性，也就是基因之间的关联性；b代表利他行为中所获得的利益；c代表完成利他行为所需要付出的代价。
然而在现实中却很难定量的对Hamilton方程进行验证。
1.3微生物的限制性扩散与群体感应现象
限制性扩散使得有关联性的微生物聚集起来，达到一个相对高的水平。这样有利于公共物质的聚集和微生物的生长繁殖。
微生物能够感知生长环境的改变，然后改变自己表型去适应环境。群体感应是微生物是通过其他微生物的群体密度感应环境参数。也就是说当为生物种群密度达到一定值时，相关基因将会表达。群体感应是依靠感应微生物释放到环境中的代谢产物，或者信息素，而这些信号分子可以自由出入细胞，所以细胞内外浓度几乎相当。一旦这些信号分子达到微生物群体感应的阈值时，就会激活细菌体内受体，改变基因的表达[4]。细菌的限制性扩散给群体感应提供了便利。
不管是细菌的限制性扩散还是群体感应，通过这种合作行为最终都会使得细菌更具更强的环境适应力。如根瘤农杆菌表达毒性，使植物组织生成冠瘿氨基酸，而植物组织生成的一部分冠瘿氨基酸会被其他含有Ti质粒的个体利用。造成根瘤农杆菌的亚种群在感染区的相对于非感染区的亚种群有着更高的环境容纳量。根瘤农杆菌这种使植物发病的行为增大他们的竞争优势与在感染区含Ti质粒细菌的环境容纳量。土壤脓杆菌通过Ti质粒的表达，使得植物组织细胞产生冠瘿氨基酸，表达有毒性生物素来改变自己生存周围环境，使得环境有益于自身种群的发展[5]。