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    为构建目的质粒,本课题利用人工合成的一段包含有AatⅡ酶切位点和LacZα的490bp基因片段和用AatⅡ限制性酶切pPopCtrl1质粒回收的3913bp基因片段,通过T4 ligase 酶将两段序列连接起来,构建目的质粒,将其导入Top10F菌株中,形成新的工程菌模型。其中490bp的片段包括pUC18中的lacZα片段并在pUC18的lacZα片段两端添加lacZα基因末端到AatⅡ酶切位点当中的序列,lacZα、两端添加的序列及总的490bp的序列依次如下:
    第一段15bases:5'-gacgtcgcctgacat-3'
    第二段324bases:lacZ-alpha基因,来自pUC18
    第三段151bases:
    490bp的基因:
    5'-gacgtcgcctgacatctatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcgtaatcatggtcataccaacctcccttgcgtttattcgactataacaaaccattttcttgcgtaaacctgtacgatcctacaggtgcttatgttaagtaattgtattcccagcgatacaatagtgtgacaaaaatccaatttattagaatcaaaggactgacgtc-3'
    本课题利用限制性内切酶AatⅡ的专一性,酶切捷瑞公司合成含有目的片段的pEGFP-C1+质粒和实验室已有的pPopCtrl1质粒,产生相同的黏性末端,通过琼脂糖凝胶电泳找到目的条带,割胶回收目的DNA,使用T4 DNA连接酶连接两条DNA,合成目的质粒pPop-galac,将目的质粒转化进入不含质粒的TOP10F菌株中,对转化后的细菌进行蓝白班筛选,经过琼脂糖凝胶电泳和酶切验证,排除错误的连接方式,得到所需的正确pPop-galac质粒。进行群体感应效果验证初步实验,在细菌的种群的密度达到一个阈值后,原来不能利用乳糖的细菌开始可以利用乳糖,出现二次生长。
    3.2实验结果与分析
    3.21提取质粒
    捷瑞公司的质粒DNA小量制备试剂盒从WT与ST305所提取质粒pEGFP-C1+(含有LacZα)和pPopCtrl1(含有卡那霉素抗性基因)电泳结果如图3.1:
     
    图3.1WT中提取出的pPopCtr11与ST305中提取出的pEGFP-C1+的琼脂糖凝胶电泳图
    pEGFP-C1+质粒大于4731bp,pPopCtrl1质粒大小为4727bp。由于质粒呈环状,会出现超螺旋结构,实际电泳显示的结果会比真实值小。因此图3.1中显示出质粒大小属于正常情况。

    3.22 质粒的酶切
    用AatⅡ酶对提取的pEGFP-C1+和pPopCtrl1质粒进行酶切, pEGFP-C1含有多个AatⅡ酶切位点,切开的片段比较多, 490bp的片段是目的基因所在的片段。pPopCtrl1质粒则有两个AatⅡ酶的酶切位点,酶切出两段DNA,大小为3913bp的DNA含有目的基因。AatⅡ酶切体系见表3.1:
    表3.1AatⅡ酶的酶切体系
    反应物    体积/μL
        见下一页
    续表:    
    超纯水    6.0
    缓冲液    2.0
    DNA    10.0
    AatⅡ    1.0
    AatⅡ酶酶切的结果如图3.2:
    图3.2AatⅡ酶酶切pPopCtr11和Pecfp-C1+后的电泳图
    pEGFP-C1+和pPopCtrl1质粒酶切产生了所需的3913bp和490bp片段。因为切割后质粒呈现线状,所以实际大小与测量值相符。通过多泳道的割胶回收提高目的DNA的回收率。

    3.23目的条带的割胶回收
    使用捷瑞公司的GenClean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对酶切的目的基因进行割胶回收,对回收的片段进行电泳验证,电泳结果如图3.3:
     
    图3.3 割胶回收目的基因的琼脂糖凝胶电泳图
    回收得到的片段大小正确,回收产物浓度较小,说明割胶回收率低。

    3.24 酶切产物的连接
    割胶回收的目的基因用电泳验证后,使用T4 DNA连接酶连接,T4 DNA连接酶反应体系的组分见表3.2:
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