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2.26 酶切产物的连接
割胶回收的目的片段经过电泳验证后，使用T4 DNA连接酶连接。DNA连接酶可以催化双链DNA平头末端或黏性末端相邻核酸的5′-PO4和3′-OH连接反应。本实验中酶切后的产物具有黏性末端，因此按黏性末端连接来设计反应体系。反应体系的组分见表2.4：
表2.4 T4连接酶反应体系组分
反应物 体积/μL
pEGFP-C1+ 5.0
pPopCtrl1 5.0
10×T4 DNALigase Buffer 2.0
T4 DNA Ligase 1.5
ddH2O 7.0
酶切反应条件：22℃，10min，然后65℃,10min灭活。
2.27 目的质粒的转化
将连接好的质粒pPop-galac转化到Top10F细菌。由于正确的连接产物可以表达卡那霉素抗性基因和LacZα，所以导入了正确连接质粒的细菌可以在含有卡那霉素并涂有IPTG和X-Gal的LB平板上生长，而且产生蓝色菌落。转化的具体步骤如下：
（1）取1mLA600nm约0.5-0.6的菌液到1.5mL的微量离心管中。
（2）4000rpm离心4-5min。彻底去除上清，再加0.1mL的预冷的SSCS（一步法制备感受态细胞溶液）溶液轻轻悬浮菌体。
（3）加入100pg-10ng用于转化的DNA。
（4）混匀DNA和细胞，冰浴30min，然后在42℃放置90s，再在冰上放置15-20min。
（5）加0.8mL的LB液体培养基到离心管中，而后在37℃，200rpm下培养1小时。
（6）4000rpm离心5min，吸掉0.8mL上清液，用剩余的培养基使细胞重悬。
（7）将剩余细胞涂布于相应抗性的平板上培养，观察结果。
2.28 目的质粒的验证
在用T4 DNA连接酶连接质粒时，会出现多种连接情况。首先对选取的菌落扩菌，进行蓝白斑实验验证，确定细菌含有LacZ基因与抗卡那霉素基因， Top10F缺失LacZ段。通过蓝白斑对刚转化的工程菌的蓝白斑验证方案如表2.5：
表2.5刚转化后工程菌的蓝白斑验证
编号 细菌 碳源与诱导剂 实验时间
a Top10F 乳糖
24小时
b T 乳糖
c T 乳糖IPTG
然后观察菌落颜色。
根据酶的单一性，选取NcoI酶对目的质粒连接方式进行验证。NcoI酶的反应体系如表2.6：
表2.6NcoI酶的反应体系
反应物 体积/μL
DNA 4.0
见下一页
续表：
超纯水 13.5
缓冲液 2.0
NcoI酶 0.5
酶切反应条件：22℃，10min，然后65℃,10min灭活。
2.29 工程菌株的生长曲线
有氧、TBK条件下，以OD600为纵轴，以生长时间T/h为横坐标的生长曲线的绘制方法：将8个克隆经中的JT4接种于LB培养基培养过夜后，按0.1%的接种量分别转接至10ml含卡那霉素TBK培养体系的阳性管和对照管中。对照管不加乳糖，同时作3个平行试验。设置方案如表2.7：
表2.7有氧、TBK条件下生长曲线测定方案
管号 培养基/TBK OD600
1 空白对照
2 空白对照
3 空白对照
4 乳糖
5 乳糖
6 乳糖
7 先加IPTG,生长到17小时加入乳糖
8 先加IPTG,生长到17小时加入乳糖