MiRNA在动物体内的合成方式已得到相关实验的研究和证实。首先,RNA聚合酶II催化miRNA的基因转录生成初级miRNA,初级miRNA又会被Drosha和DGCR8酶切割成前体miRNA,而前体miRNA在被转运蛋白exportin5由细胞核转运至细胞质后又会被Dicer酶剪切成双链miRNA,然后双链会解链为单链,单链成熟miRNA能够与RNA诱导沉默复合体结合形成miRNP复合体,最后mRNA基因水平上的调节就是由miRNA和RISC的复合体—miRNP介导的,利用miRNA上的序列与mRNA的3′UTR不完全互补结合识别,降解mRNA来抑制靶基因的表达[3]。
MicroRNAs(miRNAs)是一种小的,类似于但不同于siRNA的分子,siRNA是在RNAi过程中形成的中间体,是在人工插入或病毒感染dsDNA时形成的,主要来源于转基因或病毒RNA,而且siRNA主要是以双链形式存在,其3′端存在两个非配对的通常为UU的碱基,siRNA与靶mRNA可以完全互补配对结合,因此siRNA的靶序列如果有一个核苷酸突变,就会影响到RNAi的沉默效应,siRNA主要在转录后水平通过RNAi途径发挥作用。与siRNA不同的是,miRNA则是细胞内RNA的固有成分之一,主要来源于内源转录本,是由具有发夹结构的pre-miRNA转变而来的,而且其主要是以单链形式存在,miRNA能够与靶mRNA以不完全形式互补,因此存在错配现象,靶mRNA如果有一个位点发生突变现象,虽然miRNA就是不完全识别的,但也不会影响到miRNA途径的调节效应,miRNA主要是在蛋白质水平通过miRNA途径发挥作用[4]。
由有关文献可知[5],miRNA能够参与乳腺、肌肉、皮肤毛囊的发育和具有繁殖的机能,虽然这是一篇关于山羊的文献,但我们仍可以猜测在绵羊上miRNA同样具有相同或者相似的功能。
本实验研究的是miR-1197在绵羊不同组织中的表达,miR-1197是miRNA的一种,它是位于18号染色体由真核基因编码的miRNA,长度为129bp,其序列为 GAGGCGAGGTCGGCATCCCTTCCTGGTATTTGAAGACGCGGTTGACCATGGTGTGTACGCTTT
ATTTATGACGTAGGACACATGGTCTACTTCTTCTCGATATCACATCTTCGCCTTGGAAGACCTTCC[6]。
本实验旨在通过运用real-time PCR方法来检测miR-1197在绵羊10种肠胃组织中的差异性表达情况,为后续研究及探讨miR-1197与各组织器官的发育、分化、功能文持及与疾病发生之间的关系极其发生机制提供前期实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本
产地于徐州的湖羊。
1.1.2 仪器及试剂
超低温冰箱(美国Thermo),超净工作台,单人净化工作台,液氮罐,研钵,移液枪,高速台式冷冻离心机,电子天平,台式高速离心机,掌上离心机,NANODROP2000C spectrophotometer (美国Thermo),PCR仪(Thermal cycler),微波炉,电泳仪,凝胶成像分体系统及转印槽,实时荧光定量PCR仪(BioSoar),直冷式冷藏冷冻箱(SIEMENS),LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂),卧式冷柜(Haier),冰盒,干燥箱;酒精,液氮,RNAIiosplus,氯仿,异丙醇,乙醇,5×gDNA Eraser Buffer ,gDNA Eraser ,RNA ,RNase Free dH2O,Prime Script R-T Enzyme Mix1,5×Prime Script Buffer2(for realtime),R-Tprimer ,18s-rRNA primer ,RNase Free dH2O ,2×Taq Master Mix(Dye plus),miR-1197PF16引物GPRb引物,cDNA,水(PCR),琼脂糖,0.5×TBE 缓冲液,gelview核酸染料,SYBR Premix Ex Taq(Ⅱ)(2×)(Tli RNase H plus),Rox Reference Dye(50×),miR-1197RT8引物,18s-bPF 引物,18s-bPR 引物。
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