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摘要：酵母双杂交是研究蛋白质相互作用的一种常用方法。传统的酵母双杂交载体是利用酶切-连接方法进行构建的，步骤复杂繁琐，受酶切位点限制，成功率不高，本实验利用gateway技术构建载体，更加简便、快捷、高效。本实验完成了对酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7的gateway改造，经验证正确。39315
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毕业论文关键词：酵母双杂交系统;gateway技术; pGADT7; pGBKT7
Optimization of Yeast Two Hybrid System by Gateway Technology
Abstract: The yeast two hybrid system is a widely used technology in protein interactions study. The traditional yeast two hybrid vector is constructed by enzyme digestion-ligation method with complicated steps, restricted by enzyme sites, fragment length. In this study, we use gateway technology to modify vectors in yeast two hybrid to generate more convenient and more efficient constructor. This study completed the gateway-modified yeast two hybrid vectors pGBKT7 and pGADT7.
Key words: Yeast two-hybrid system; Gateway technology; pGADT7; pGBKT7
目 录
摘要： - 1 -
ABSTRACT: - 1 -
引言 - 1 -
1.材料与方法 - 2 -
1.1 主要材料 - 2 -
1.1.1 所用载体： - 2 -
1.1.2 菌株 - 2 -
1.1.3 酶及试剂： - 2 -
1.2 主要设备 - 3 -
1.3 实验方法 - 3 -
1.3.1 酶切： - 3 -
1.3.2 连接： - 3 -
1.3.3 酶切、胶回收： - 4 -
1.3.4 大片段补平： - 4 -
1.3.5 大肠杆菌转化： - 4 -
2.结果与分析 - 4 -
2.1酵母双杂交载体PGADT7和PGBKT7的酶切和补平 - 4 -
2.2 含有GATEWAY载体PBS-GATEWAY-RFA 的GW酶切盒子 - 5 -
2.3PGADT7和PGBKT7与GATEWAY盒子序列的连接，转化 - 5 -
2.4PGADT7-GW和PGBKT7-GW载体的验证 - 6 -
3.讨论 - 7 -
参考文献 - 9 -
致 谢 - 11 -
酵母双杂交载体的Gateway改造引言
蛋白质是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，体内重要的生理活动大都依赖蛋白质来完成的，因此，蛋白质是所有生命活动的重要物质基础，没有蛋白质就没有生命[1,2]。而体内的生命活动都依赖于蛋白-蛋白、蛋白-核酸间的相互作用[1,2]。蛋白质与生物大分子间的作用靠细胞内环境完成，作用时间及作用力差异非常大，传统的生物化学方法很难检测到生物体内瞬间发生的蛋白质与蛋白质之间的相互作用[1,2]。酵母双杂交系统可以用来在体内检验蛋白质间的相互作用，还可以用来发现新的作用蛋白质，对蛋白质组中特定的代谢途径，以及蛋白质间相互作用关系的认识上也发挥了非常重要的作用。并在此技术的基础上相继发展了单杂交，三杂交，逆向双杂交等多种新技术，大大加速了生命科学领域的研究[2]。
GAL4酵母双杂交系统是在真核生物调控转录起始过程中，利用转录因子GAL4蛋白的特点所建立的[3,4]。该转录因子由两个功能相互独立的结构域构成：DNA结合结构域简称BD和转录激活结构域简称AD。其中，BD与诱饵蛋白（X蛋白质）融合；AD与猎物蛋白（Y蛋白质）融合，把这两种融合蛋白共同表达于宿主酵母细胞中，如果这两个待测蛋白发生了相互作用，那么 AD 与 BD就通过X和Y的相互作用形成一个完整的转录激活因子，并激活相应的报告基因表达，酵母就会生长或变蓝，从而，通过酵母生长情况来验证蛋白质间的相互作用[3,4]。