菜单
  

    由于传统的酶切-连接技术要求严格,步骤较复杂,容易出错,成功率不高。         Gateway技术是在噬菌体的位点特异重组反应的基础上,目的片段添加重组位点,将PCR产物与含有重组位点的供体载体相混合,进行BP反应来获得入门载体 (entry clone),入门载体可以和不同用途的目标载体进行LR反应获得相应的表达载体,该技术不再使用限制性内切酶和连接酶[5-7]。因此本试验利用gateway技术改造酵母双杂交载体可极大的方便酵母双杂交载体的构建。
    1.材料与方法
    1.1 主要材料
    1.1.1 所用载体:
    酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7来自colontech pDONR207, pBS-Gateway-rfA来自Thermal(Invitrogen)
    1.1.2 菌株:
    大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DB3.1感受态细胞由周口师范学院植物遗传与分子育种实验室提供。
    1.1.3 酶及试剂:
    T4DNA连接酶和内切酶购自NEB公司; DNA Marker购买自北京全式金生物技术公司;质粒提取试剂盒和胶原回收试剂盒购买自艾德莱生物科技公司。
    1.2 主要设备
    高速离心机;培养箱;水浴锅;电磁炉;制冰机;摇床等。
    1.3 实验方法
    1.3.1  酶切:
    以检测为目的酶切用15微升体系,配比见下,放置于37℃培养箱1小时以上。
    Buffer    1.5微升
    质粒    5微升
    酶I
    0.2微升
    酶II
    0.2微升
    补水至15微升。
    以构建载体为目的酶切用50微升体系,配比见下,放置于37℃培养箱2小时以上
    Buffer    5微升
    质粒    20微升
    酶I
    2微升
    酶II
    2微升
    补水至50微升。
    1.3.2 连接:
    用NEB T4 ligase,10微升体系,配比如下, 16℃,过夜培养。
    Insert    6微升
    Vector    2微升
    T4 ligase buffer    1微升
    T4 ligase    1微升
    1.3.3 酶切、胶回收:
    按照其实验说明书操作。
    1.3.4 大片段补平:
         用NEB公司klenow大片段,使用参照其说明书
    1.3.5 大肠杆菌转化:
    -80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞加入目的DNA轻混匀,放在冰上30分钟。然后将感受态在42℃水浴锅中将感受态热激1分钟,拿出后立即放置于冰上2分钟。无菌条件下,感受态中加入600微升LB(不含抗生素)混匀后37℃摇床45分钟。在无菌条件下,将菌液均匀涂布到含有相应抗生素的LB固体培养基上,待完全吸收平板上的菌液后,将平板倒置于37℃培养箱培养过夜。
    2.结果与分析
    2.1酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7的酶切和补平
    经分析pGADT7和pGBKT7用BamH I单酶切,补平后不影响读码框。所以选用BamH I将这两个质粒单酶切,然后切胶回收。回收后产物Klenow大片段补平,纯化为Vector
  1. 上一篇:双酚A对豆科作物幼苗地上器官生长的影响
  2. 下一篇:鱼类脂肪酸合成关键酶的鉴定与进化分析
  1. 不同提取方法提取酵母RNA的比较

  2. 酵母质量对发酵过程中无机磷利用影响

  3. 酵母冷冻时间对发酵过程中无机磷利用的影响

  4. 在前导肽引入N-糖基化位点...

  5. 外切葡聚糖酶基因(CBH2)...

  6. 重组马克斯克鲁维酵母产...

  7. 乳酸克鲁维酵母产β-半乳...

  8. java+mysql车辆管理系统的设计+源代码

  9. 河岸冲刷和泥沙淤积的监测国内外研究现状

  10. 大众媒体对公共政策制定的影响

  11. 电站锅炉暖风器设计任务书

  12. 杂拟谷盗体内共生菌沃尔...

  13. 乳业同业并购式全产业链...

  14. 中考体育项目与体育教学合理结合的研究

  15. 当代大学生慈善意识研究+文献综述

  16. 十二层带中心支撑钢结构...

  17. 酸性水汽提装置总汽提塔设计+CAD图纸

  

About

751论文网手机版...

主页:http://www.751com.cn

关闭返回