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    Prescription of reagent

    30%单体贮备液 30 g丙烯酰胺,0.8 g N,N-甲叉丙烯酰胺,溶解后加水定容至100 mL,过滤,4℃保存

    4×分离胶缓冲液 18.17 g Tris,0.4 g SDS,加水溶解后用1 M HCI调整pH至8.8,定容至100 mL

    4℃保存

    4×浓缩胶缓冲液 6.06 g Tris,0.4 g SDS,加水溶解后用1 M HCl调整pH至6.8,定容至100 mL

    4℃保存

    10%过硫酸铵 0.1 g过硫酸铵,1 mL水,现配现用

    10%TEMED 0.1 mL TEMED,0.9 mL水,4℃保存

    蛋白提取液 50 Mm Tris-HCl,0.01 M 2-巯基乙醇,pH 8.0,4℃保存

    4×样品缓冲液 0.6g Tris,1 SDS,12.5 mL甘油,加水溶解后用1 M HCl调整pH至8.0,再加0.05 g溴酚蓝,2.5 mL -巯基乙醇,定容至50mL,分装至-20℃保存

    电极缓冲液 3.03 g Tris,1.0g SDS,14.4g甘氨酸,加水溶解后用1 M HCl调整pH至8.3,定容至1000 mL

    固定液 40%甲醇,10%乙酸,50%水

    R250染色液 125 mL甲醇,50 mL乙酸,0.5 g考马斯亮蓝R250,溶解一夜后定容至500 mL

    脱色液 100 mL乙酸,100 mL甲醇,800 mL水混匀

    12.5% SDS-PAGE分离胶 15 mL分离胶缓冲液,25mL Arc-Bis,19 mL蒸馏水,1 mL 10%过硫酸铵,20 uL TEMED

    5% DSD-PAGE浓缩胶 1.5 mL浓缩胶缓冲液,2.5 mL Arc-Bis,5 mL蒸馏水,0.5 mL10%过硫酸铵,20 L TEMED

    1.2.2 蛋白的提取和电泳样品的准备

    (1)从每粒大豆种子上刮取0.1g粉末,置于1.5 mL离心管中,加500L蛋白提取液置于37℃摇床振荡2h;

    (2)振荡好后在4 ℃、12000 rpm条件下离心20 min,取上清液;

    (3)吸取5μL相同浓度的样品按4:1比例加入样品缓冲液;

    (4)样品充分涡旋混匀并煮沸3~5 min备用。

    1.2.3 SDS-PAGE电泳

        十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳采用的是不连续垂直凝胶电泳,凝胶厚度为1mm,浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为12.5%。

    (1)组装凝胶模具,按照说明书组装好灌胶模具,配置1.5%琼脂凝胶,封胶。对于Bio-Rad的微型凝胶电泳系统,在螺丝拧紧之前必须确保凝胶玻璃板和底部胶条紧密相接,防止细微不匹配导致凝胶泄露;

    (2)配置分离胶,加入过硫酸铵和TEMED后,轻轻搅拌使其混匀(过硫酸铵现配现用,操作时戴手套);

    (3)小心将分离胶溶液灌入模具中(分离胶溶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm处);

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