3)结实率统计:将收回单株烘干后统计每穗的饱粒数和瘪粒数,计算每穗结实率(饱粒数/总粒数×100%),然后取其平均值作为单株结实率。
1.2.3 构建极端混池
1.2.3.1 DNA提取叶片选择
在分离家系中选择12个结实率最高的单株和12个结实率最低的单株,取其对应编号的叶片。
1.2.3.2 水稻叶片DNA提取
DNA提取采用CATB提取法
1)根据表1配制CATB液
表 1 CATB 液配方
试剂 用量
CATB 20 g
NaCL 81.82 g
Tris-HCL 12.14 g
EDTA 7.45 g
ddH2O 室温定容1000 mL,PH调节为8.0
2)具体步骤如下:
A.将水稻叶片剪碎放置于2 mL的Eppendorr管中,同时放入一颗事先洗净直径3 mm的玻璃珠在Eppendorr管里中。将装有样品Eppendorr管放在磨样盒里面,倒入液氮冷冻3 min,然后放在磨样机上磨样,时间40 s;
B.加入0.65 mL的CATB提取液,并将管盖压实。颠倒摇匀后放于65℃烘箱中30 min,每隔10 min颠倒摇匀一次;
C.30 min后,将管取出。加入0.5 mL氯仿/异戊醇(24:1),颠倒摇匀后再次放在65℃烘箱中10 min,每隔5 min颠倒摇匀一次;
D.10 min后将管取出12000 rpm离心8 min。取上清液于新的1.5 mL Eppendorf管中,加0.5 mL异丙醇,混匀后于-20℃冰箱静置30 min以上;
E.30 min后取出,12000 rpm离心8 min;
F.弃上清液,加入0.5 mL 70%乙醇,静置5 min;
G.1200 rpm离心1 min,缓慢倒掉乙醇,置于室温自然晾干;
H.加入适量ddH2O,-20℃保存备用。
1.2.4 引物设计
本次实验所用的引物为SSR标记,SSR标记从本实验室保存的2000多对公开发表的引物中挑选,引物信息和序列参照GRAMENE合成。引物设计软件选用Primer Premier 5.0,设计的引物长度在22bp左右,GC含量在40%~60%。