木质素降解菌CY的分离鉴定及其生长特性研究(2)

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摘要 I

Abstract . II

目录 .. II

图清单 .. VI

表清单 .. VI

绪论 1

1 材料与方法 .. 1

1.1 实验材料 . 1

1.1.1 菌种 . 1

1.1.2 培养基 2

1.1.3 主要试剂 .. 2

1.1.4 主要仪器设备 2

1.2 木质素降解菌的分离与筛选 . 2

1.2.1 木质素降解菌的富集 2

1.2.2 木质素降解细菌的初步筛选 3

1.2.3 木质素降解细菌的分离纯化 3

1.2.4 菌株降解木质素的测定 .. 3

1.3 菌种的鉴定 .. 3

1.3.1 菌落形态观察 3

1.3.2 扫描电镜观察 4

1.3.3 革兰氏染色 . 4

1.3.4 培养与生理生化鉴定 4

1.3.5 16S rDNA PCR 扩增、序列测定及同源性比较 4

1.4 木质素高效降解菌株生长特性的测定 . 5

1.4.1 木质素高效降解菌株生长曲线的测定 .. 5

1.4.2 pH 对木质素高效降解菌株生长的影响 6

1.4.3 温度对木质素高效降解菌株生长的影响： 6

1.4.4 盐浓度对木质素高效降解菌株生长的影响： .. 6

2 结果与分析： . 6

2.1 木质素高效降解菌株 CY的分离、筛选 .. 6

2.2 木质素高效降解菌株CY的鉴定 .. 6

2.2.1 木质素高效降解菌株 CY的形态特征 6

2.2.2 木质素高效降解菌株 CY的生理生化鉴定 . 8

2.2.3 木质素高效降解菌株 CY的16SrDNA 鉴定结果及系统发育分析 . 8

2.3 木质素高效降解菌株生长特性的测定 .. 12

2.3.1 木质素降解菌株 CY的生长曲线的测定 12

2.3.2 pH 对木质素降解菌株 CY生长的影响 .. 12

2.3.3 温度对木质素降解菌株 CY生长的影响 13

2.3.4 盐浓度对木质素高效降解菌株 CY生长的影响 13

3讨论 . 14

参考文献 .. 15

致谢 . 16
1 绪论木质素是广泛存在于植物体中的芳香性高聚物，无定形、其分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元，根据单体的不同，可以分为三种：S-木质素、G-木质素、H-木质素[1]。木质素的资源十分丰富，是植物细胞壁的成分之一，因为其主要位于纤维素纤维之间，所以可以起到抗压的作用。在木本植物中，木质素虽然是世界上第二位最丰富的有机物，仅次于纤维素，但是其资源并没有得到有效、充分的利用[2]。例如在造纸产业中，大量的木质素实际作为一种副产物被排放，这不仅是一种资源的浪费，而且对环境造成严重污染。通常来看，采用物理和化学的处理方法，木质素的排放可减少约 50%，但缺点是治理成本高，容易造成二次污染。利用微生物降解木质素的方法，不仅可以减轻环境的污染的压力，还可以实现资源的充分利用。因此，了解木质素的结构特点以及认识其生物降解的研究进展，从环境中分离、筛选出能降解木质素的微生物，对于木质素的合理化利用将具有很重要的意义[3]。本实验通过从连云港新鲜海水中分离出能降解木质素的海水菌，试着从生物学角度寻找降解木质素的方法，通过常规方法对样品进行富集、分离和纯化，得到对木质素降解率较高的菌株，接着通过对菌落形态、革兰氏染色、电镜等手段，对其进行了形态观察，通过血清学实验，对其进行了生理生化鉴定；通过对其基因组序列进行 PCR 扩增和16SrDNA测序1 绪论木质素是广泛存在于植物体中的芳香性高聚物，无定形、其分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元，根据单体的不同，可以分为三种：S-木质素、G-木质素、H-木质素[1]。木质素的资源十分丰富，是植物细胞壁的成分之一，因为其主要位于纤维素纤维之间，所以可以起到抗压的作用。在木本植物中，木质素虽然是世界上第二位最丰富的有机物，仅次于纤维素，但是其资源并没有得到有效、充分的利用[2]。例如在造纸产业中，大量的木质素实际作为一种副产物被排放，这不仅是一种资源的浪费，而且对环境造成严重污染。通常来看，采用物理和化学的处理方法，木质素的排放可减少约 50%，但缺点是治理成本高，容易造成二次污染。利用微生物降解木质素的方法，不仅可以减轻环境的污染的压力，还可以实现资源的充分利用。因此，了解木质素的结构特点以及认识其生物降解的研究进展，从环境中分离、筛选出能降解木质素的微生物，对于木质素的合理化利用将具有很重要的意义[3]。本实验通过从连云港新鲜海水中分离出能降解木质素的海水菌，试着从生物学角度寻找降解木质素的方法，通过常规方法对样品进行富集、分离和纯化，得到对木质素降解率较高的菌株，接着通过对菌落形态、革兰氏染色、电镜等手段，对其进行了形态观察，通过血清学实验，对其进行了生理生化鉴定；通过对其基因组序列进行 PCR 扩增和16SrDNA测序，与EzBioCloud 网站中中收录的与其同源性较高的菌株进行了系统发育分析并通过 MAGE 5.1 邻接法(Neighborhood-joining)进行关系分析和系统进化树的构建[4]。此外，对其生长特性也进行了研究。通过在自然界分离出高效降解木质素的菌株，对其进行大规模培养，达到高效利用木质素、保护环境的目的。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌种本研究用于分离筛选的菌株来源：连云港海域（海拔 0 米，东经 119.66°，北纬34.59° ）。1.1.2 培养基海水液体无机培养基：Solution A: 22.79 g NaCl，3.98 g Na2SO4，0.72 g KCl，0.27 g NH4Cl， 47.2 mg Na2HPO4， 83 mg NaBr， 31 mg NaHCO3， 27 mg H3BO4， 2.6 mg NaF， 1.3 g TAPSO，890 mL H20，pH 7.6，高压灭菌；Solution B: 11.18 g MgCl2•6H2O，1.46 g CaCl2•2H2O， 24 mg SrCl2•6H2O， 100 mL H2O，高压灭菌； Solution C: 0.02 g FeCl4•4H2O， 100 mL H2O，过滤灭菌。按照 890 mL Solution A，100 mL Solution B，10 mL Solution C的比例混合配制[5]。海水营养培养基：在以上培养基中添加 2 g/L胰蛋白胨和1 g/L酵母提取物，混匀，高压蒸汽灭菌后与 Solution C 混匀，则为海水营养培养基。筛选培养基：以香草酸为唯一碳源的海水无机盐培养基是在海水无机盐培养基经过灭菌后冷却到50 一60°C 后向其中加入适量的香草酸配制成所需要的浓度。固体斜面培养基：在海水营养培养基中加入 2%的琼脂粉，制成试管斜面。无机盐培养基：1 L H2O、1.5 g/L NH4NO3、0.5 g/L KH2PO4、1.5 g/L K2HPO4、0.5 g/L NaCl、0.2 g/L MgSO4•7H2O。 1.1.3 主要试剂无机试剂：氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、溴化钠、碳酸氢钠、氟化钠、高硼酸、-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、硫酸钠、氯化镁合六水、氯化钙合二水、氯化锶合六水、氯化铁合四水、氯化铵、氢氧化钠、盐酸、EB 染液、PBS缓冲液等。有机试剂：蛋白胨、酵母粉、木质素、琼脂粉、乙醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、纤维二糖、乳糖、山梨醇、戊二醛等。革兰氏试剂：草酸铵结晶紫染液（初染）、路哥氏碘液（媒染）、95%乙醇（脱色）、番红复染液（复染）、香柏油（镜检）。 PCR 试剂：TaqDNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+、Marker 和loading buffer、正反引物、双蒸水。 1.1.4 主要仪器设备 PCR 仪、高压蒸汽灭菌锅、稳压稳流电泳仪、紫外凝胶成像系统、恒温摇床、紫外分光光度计、冰箱、Eppendorf 微量移液器、无菌工作台、生物显微镜、扫描电镜、电热干燥箱、微孔滤膜、电子分析天平等。，与EzBioCloud 网站中中收录的与其同源性较高的菌株进行了系统发育分析并通过 MAGE 5.1 邻接法(Neighborhood-joining)进行关系分析和系统进化树的构建[4]。此外，对其生长特性也进行了研究。通过在自然界分离出高效降解木质素的菌株，对其进行大规模培养，达到高效利用木质素、保护环境的目的。