毕赤酵母表达系统也不是尽善尽美的,比如有些蛋白在利用毕赤酵母系统分泌表达时会有糖基化问题的出现,造成最终获得纯化的目的产物时带给我们很多不必要的麻烦,现在我们利用基因工程中点突变的方法引入N-糖基化位点的方法来判断突变前后糖基化对弹性蛋白酶稳定性的影响。
N-糖基化修饰是真核细胞内最常见的一种翻译后修饰,这种修饰就是把寡糖链加到在内质网内腔中新合成肽的特定N-糖基化位点Asn残基上。在弹性蛋白酶的氨基酸序列中存在三个N-糖基化修饰位点(Asn-Xaa-Ser/Thr),当弹性蛋白酶基因在真核的毕赤酵母中表达时,重组酶蛋白就会被N-糖基化修饰,而N-糖基化修饰可能对酶蛋白的稳定性、活性和表达水平有着重要的影响,因此,有必要研究N-糖基化修饰对重组酶的影响,利用定点突变技术改造N-糖基化修饰位点也是一种优化重组弹性蛋白酶活性和稳定性的手段。
N-糖基化途径中的中心酶是寡糖基转移酶(OST),在内质网中,N-糖链是在寡糖转移酶作用下加到糖基化位点的,而寡糖转移酶更偏好Asn-Xaa-Thr的糖基化位点[12 ],它更易结合的Asn-Xaa-Thr。据报道,Asn-Xaa-Thr的糖基化效率是Asn-Xaa-Ser的2到3倍[13-14 ],本文研究Asn-Xaa-Thr替代Asn-Xaa-Ser对rPAE表达的作用。