外植体(叶、愈伤组织等)通过诱导培养分化出胚状体,再经球形期、心形期、鱼雷期和子夜期发育成再生植株。
(4)原球茎
外植体经原球茎途径分化形成植株。
(5)无菌短枝扦插
用已经发育或除去顶芽后萌发的腋芽,连同短枝进行表面消毒,在无菌条件下培养,使其生长并诱导生根,为此在短时间内即可获得植株,尤其对珍贵的优良树种或花卉品种是简单有效的方法。
就木本植物而言,植株再生途径可分为两类[14]:一是先从植物的外植体上诱导出合适的愈伤组织,再将愈伤组织转接到相应的培养基上诱导出不定根或不定芽原基。这属于间接器官发生过程;二是不采用诱导愈伤组织的方法,直接从原始外植物植体上诱导产生不定芽或不定根。这属于直接器官发生。
1.1.5 植物组织培养的步骤[15]
(1)培养材料的采集
植物组织培养所用的材料非常广泛,可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶等,有时也使用花粉粒或花药,其中根尖不易灭菌,一般很少采用。
(2)培养材料的消毒
①先将材料用流水冲洗干净,最后一遍用蒸馏水冲洗,再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干;
②在无菌坏境中将材料放入75%洒精中浸泡30s左右;
③将材料移入漂白粉的饱和液或0.01%升汞中浸泡消毒4min到10min;
④将材料取出后用无菌水冲洗4到5次。
(3)外植体的制备
将已消毒的植物材料,用无菌刀、剪、镊等工具,在无菌的环境下,剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等,叶片则不需剥皮。然后切成大小合适的小片作为外植体。试验操作中必须保持无菌的环境条件。文献综述
(4)接种和培养
①接种:在无菌坏境下,用无菌镊子将处理好的外植体接在相应的培养基上,每瓶接种数视外植体大小而定。
②封口:接种后,迅速将瓶口用无菌封口膜封住。
③温度:接种后的培养基大多应保持在25℃到27℃左右。
④增殖:将初代培养过的植物外植体进行分株或切段,再转接入继代培养基进行诱导增殖,由此来扩大繁殖系数,这是组培的关键阶段之一。增殖一次后可根据试验的具体需要进行再增殖。
⑤根的诱导:外植体经继代培养后一般会形成不带根的不定芽和侧芽等植物器官,这时候必须先将这些植物器官分株,然后转到生根培养基上进行诱导生根。(5)组培苗的练苗移栽
试管苗从无菌和光、温、湿稳定的环境进入自然环境,必须进行炼苗。通常在移植前,首先要打开培养容器,在室内承受3天的自然光照,然后将苗取出,用自来水冲洗根系上的营养基,再移栽到基质中。为了防止植株发生烂苗现象,所用的基湿度不宜太大。
1.1.6 植物组织培养的意义及应用
20世纪60年代以后,生物技术在农业、食品工业、能源、环保以及医药等各个领域都显示出极大的生产应用潜力,作为其重要手段与途径的植物组织培养也日益受到重视和探索发展,成为现代农业及多种行业重要的技术手段,开始在生产上得到广泛应用,并且逐渐朝着产业化方向发展[16]。植物组织培养技术除了运用于植物的脱毒和快速繁殖外,还可用于[17]:
(1)育种研究
在包括单倍体育种、胚培养、单细胞培养突变体的选择与应用、体细胞杂交育种、转基因育种等育种研究中,植物组织培养技术得到了广泛的应用,并且取得了重要的成果。植物组织培养技术已经成为改良作物、获得杂种植株、筛选突变体培养成植株用作遗传学研究、进行体细胞杂交育种、建立植物的遗传再生体系的重要的途径和方法。