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    摘要：冰晶核蛋白（ice nucleation protein, INP）是存在于多种革兰氏阴性菌中的分泌型表面蛋白质，因其可作为细菌细胞表面展示系统的运载蛋白而引起研究者的兴趣。本研究主要利用来源于丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的冰晶核蛋白N末端结构域（InpN）作为运载蛋白，绿色荧光蛋白（GFP）为报告蛋白，在前期工作基础上，通过酶切、PCR等方法，构建能表达2拷贝InpN的大肠杆菌细胞表面展示重组质粒pTrcHisC-inpN-gfp，并在大肠杆菌受体菌JM109中表达。通过绿色荧光强度检测验证该重组质粒构建成功。该重组质粒的构建为进一步研究InpN的展示性能奠定了基础。关键词： 冰核基因、多拷贝、基因重组。8833
    The construction of cell surface display system using tandem repeats of Ice nucleation protein
    Abstract: The ice nucleation protein (INP), a secretory protein from several Gram-negative bacteria, has drawn a wide intresting for development of the bacterial cell surface display system while used as a functional carrier protein. In this study, the N-domain of INP from Pseudomonas syringae was used as carrier protein and the green fluorescent protein (GFP) was used as passenger protein. Based on the previous work, a recombinant plasmid named pTrcHisC-(inpN)2-gfp, which contained two copies of inp-N gene, was constructed by PCR and restriction enzyme digest. Then the plamid was expressed in the Escherichia coli JM109. The recombinant plasmid was proved to be successfully constructed using the determination of fluorescence intensity. The construction of this recombinant plasmid can be used for the functional analysis of InpN as a carrier protein.
    Keywords: ice nucleation gene, multi-copy, gene recombination.
    目录
    1前言    5
    1.1冰核蛋白    5
    1.1.1冰核蛋白的结构特性    5
    1.1.2冰核蛋白的作用机制    7
    1.2 细菌细胞表面展示技术概述    7
    1.3 冰晶核蛋白的细胞表面展示研究进展    7
    1.3.1 报告蛋白展示    8
    1.3.2 工业酶展示    8
    1.3.3抗原抗体展示    8
    1.3.4多肽文库的细菌细胞表面展示    9
    1.3.5真核基因展示    9
    1.3.6重金属亲合蛋白/多肽的细菌细胞表面展示    9
    1.4展望    10
    2.本课题的研究目的和意义    10
    3.材料与方法    10
    3.1 材料    10
    3.1.1 菌种与质粒    10
    3.1.2 试剂    11
    3.1.3 培养基和培养条件    11
    3.2 实验方法    11
    3.2.1质粒提取    11
    3.2.2 引物设计    12
    3.2.3  PCR扩增目的基因片段    12
    3.2.4  PCR产物的连接与转化    13
    3.2.5 两拷贝冰核基因表面展示重组质粒的构建与鉴定    14
    4 结果分析    15
    4.1 pTrcHisC-inpN-gfp质粒的提取    15
    4.1 PCR扩增inpN基因片段    16
    4.2 pMD19T-inpN重组质粒的构建以及验证    16
    4.3  pTrcHisC-（inpN）2-gfp质粒的构建与验证    19
    4.3.1 pTrcHisC-（inpN）2-gfp质粒构建流程图    19
    4.3.2  pTrcHisC-(inpN)2-gfp质粒酶切验证图    21
    4.4 重组菌的表达与荧光强度检测    21
    5.讨论    22
    5.1碱裂解法提取质粒不成功的原因分析    22
    5.2荧光强度随拷贝数的增加而降低    23
    1前言
    1.1冰核蛋白
    1974 年, 丁香假单胞菌Pseudomonas syringae从赤杨树的腐烂树叶中被分离出来，人们发现细菌可以在细胞外膜上诱导形成冰核类蛋白，从而催化过冷水( Super Cooled Water ) 形成冰晶，于是人们认识到冰¬¬核类细菌是诱发和加重植物霜害和冻害的重要因素。此后, 又相继在其它细菌和昆虫中发现了可以充当生物冰核剂的冰核蛋白[1]。
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