GASBD基因在马铃薯中的表达对淀粉的合成及理化性质的影响(2)

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研究发现当其它结构域与SBD分离后，仍然可以与淀粉粒结合[1]。研究表明不能与淀粉粒结合的酶与SBD融合后则具有与淀粉粒结合的能力[2-4]，根据这一性质可以利用SBD-转基因平台技术对淀粉性质进行改良。所谓SBD-转基因平台技术就是将SBD基因序列与效应蛋白的编码序列相连，构建融合基因，将含有SBD的融合基因转化到植物体内。在植物淀粉生物合成过程中，利用SBD作为“锚”将含有SBD的融合蛋白定位到淀粉颗粒中。通过这一技术，可使不具备淀粉结合特性的酶蛋白重新获得与淀粉粒结合的能力，所表达的重组蛋白在淀粉生物合成过程中对淀粉结构进行改良，从而合成新型的功能淀粉。文献综述

为了研究黑曲霉糖化酶淀粉结合结构域(glucoamylase starch-binding domain，GASBD)-转基因平台技术中的GASBD基因是否对马铃薯淀粉的理化性质有影响。实验对转GASBD基因马铃薯淀粉的理化性质进行测定，包括转基因马铃薯淀粉的含量、淀粉糊化性质和热力学性质。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

直链、支链淀粉标准品、葡萄糖标准液、苯酚溶液、高氯酸溶液。

26个转GASBD基因马铃薯株系。

1.2 方法

1.2.1 马铃薯淀粉的提取

将每个转基因株系中的5株马铃薯植株的薯块，混合。从混合的薯块中取0.5kg的薯块洗净，削皮，然后切成大小为2-3 cm的小块。用1 L含有0.1% Na2SO3的去离子水在组织匀浆机中将薯块进行匀浆。先将薯块匀浆用4层纱布进行过滤，再用2 L含有0.1% Na2SO3的去离子水冲洗滤渣。将得到的滤液放于4℃冰箱中静置12h，弃掉上清液，用去离子水洗涤沉淀三次，将洗涤后的沉淀平铺在滤纸上自然晾干。将晾干的淀粉研磨成粉，即得到马铃薯淀粉。

1.2.2 Western斑点杂交分析

采用Western斑点杂交的方法[5]对转GASBD基因淀粉中的重组蛋白积累量进行分析。称取20mg转GASBD基因淀粉，加入 2×SDS样品缓冲液200μL，煮沸5分钟。冷却至室温后，用Mini Trans-Blot System 将转GASBD基因淀粉凝胶中的GASBD蛋白印迹转移到硝酸纤维素膜上。电转移条件为：200mA，4℃，120min。首先将转印后的硝酸纤维素膜放在80mL封闭液中，室温下过夜。然后用10mL TTBS缓冲液将转印后的硝酸纤维素膜洗涤4次，每次洗涤10min。加入用适量的TBS缓冲液1：500稀释后的一抗，在室温下进行温育，温育时间为2h。再用TTBS缓冲液将膜洗涤3次，每次洗涤5min，加入用TBS缓冲液1：500稀释后的二抗，在室温下进行温育，温育时间为2h。用TBS缓冲液洗涤3次，每次洗涤5min。最后用显色液显色2-3min。每个样品重复测定3次。

1.2.3 转基因马铃薯块茎中淀粉含量的分析

标准曲线的制作：分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的葡萄糖标准液(0.1 mg/mL)于试管中，加ddH2O至1.0 mL。向每支试管中加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，再加入5mL的浓硫酸，摇匀，静置5 min，在沸水浴中加热15 min。用空白管作为对照，在490 nm处测定吸光值。标准曲线的回归方程为：y=0.0087x+0.004，R2=0.9987。

马铃薯块茎中淀粉含量的测定：在马铃薯块茎收获的1周内，选取150g的马铃薯块茎作为实验材料。从选取的马铃薯块茎中称取100 g ，洗净后去皮，将马铃薯块茎放于匀浆机中，用100mL去离子水进行匀浆。首先取出5mL马铃薯块茎的匀浆液，边搅拌边加入15mL 52%的高氯酸溶液，并继续搅拌10min，再3000r离心10min，然后将上清液转入100ml容量瓶中，沉淀用15 mL 52%的高氯酸溶液再提取一次，将提取液合并，定容至100 mL。取1mL稀释100倍后的提取液，进行测定，操作同标准曲线。每个样品重复测定3次。