1. 材料和方法
1.1 实验材料和培养基
1.1.1 研究菌株
菌种:从超市买来的安琪牌高活性干酵母粉中活化,分离纯化得到的酿酒酵母。
1.1.2 培养基成分与配制方法
(1)菌种的分离纯化培养基:选用YPD培养基:溶解10 g酵母膏, 20 g蛋白胨,20 g琼脂粉于900 mL水中,高压蒸汽灭菌121℃ 20 min;灭菌后加入100 mL葡萄糖溶液(含葡萄糖20 g);自然pH。
注:葡萄糖溶液混合后在121℃高温下可能会发生化学反应,导致培养基成分变化,所以要分别灭菌后再混合[6]。
(2)马铃薯液体培养基:选用新鲜马铃薯剥皮称重200 g,将其切成小薄片于锅内煮沸50 min,不断搅拌、加水,防止糊锅,利于过滤;煮过后用12层纱布过滤;蔗糖20 g,定容至1000 mL,自然pH。
(3)无碳基础培养基:KH2PO4 3 g,MgSO4•7H2O 5 g,蛋白胨10 g,加蒸馏水定容至1000 mL, pH 6.5。高压蒸汽灭菌121℃ 20 min[7]。此培养基适用于测定酵母菌对碳源的利用(加待测碳源1%)。
(4)无氮基础培养基:葡萄糖10 g,KH2PO4 3 g,MgSO4•7H2O 0.5 g,酵母膏 0.1 g,加无氨蒸馏水定容至1000 mL,pH 6.5。高压蒸汽灭菌121℃ 20 min[7]。此培养基适用于测定酵母菌对氮源的利用(加待测氮源1%)。
1.1.3 其他实验试剂
美兰试剂,浓盐酸,氢氧化钠,无水乙醇,氯化钠,葡萄糖,乳糖,麦芽糖,蔗糖,半乳糖,KNO3,(NH4)2SO4,尿素,赖氨酸。
1.1.4 实验仪器
电子天平AL204: 梅特勒托利多仪器(上海)有限公司
实验室pH计EL20: 梅特勒托利多仪器(上海)有限公司
海尔冰箱BCD-215KCM: 青岛海尔股份有限公司
汽浴恒温振荡器THZ-82A: 上海一恒科学仪器有限公司
洁净操作台SW-CJ-2FD: 苏州安泰空气技术有限公司
立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50KB: 上海申安医疗器械厂
可见分光光度计722S: 上海菁华科技仪器有限公司
万用电炉DL-1: 北京中兴伟业仪器有限公司
多功能电磁炉C21-RK2106: 广东美的生活电器制造有限公司
显微镜CX21FS1: OLYMPUS
1.2 实验方法
1.2.1 菌株的活化与分离培养
称取安琪牌高活性干发酵粉5 g,溶于100 mL无菌水中,混合均匀。在无菌条件下,用涂布棒沾取该混合液接种于YPD培养基上,35℃恒温培养48 h。然后用接种环挑去纯种菌落,在YPD培养基上划线培养[8]。将划线培养分离得到的平板置于4℃条件下保存,以供后续实验使用。
1.2.2 酵母菌的形态学观察
首先对划线分离培养出的酵母菌进行菌落形态的观察,主要是对其菌落的颜色、大小、质地、表面特征、边缘形状、隆起度等特征[9]进行观察。
然后观察酵母菌细胞的形态特征,采用美蓝染色法。染色后在显微镜下进行观察[10]。
1.2.3 酵母菌生长曲线的测定
在无菌条件下,用接种环从平板上挑取一些菌体置于50 mL无菌水中,溶解混匀。吸取1 mL菌液至70 mL液体马铃薯培养基中。设置2个平行组,测定其OD值,最后取其平均值[11]。自然pH,置于恒温摇床中,转速设为110 r/min,连续培养48 h,每隔6 h测一次吸光值。吸收波长选定为660 nm[12]。
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