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3.5.2 试剂配制
染色液：取考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 85%磷酸，加水稀释至一升。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
标准蛋白溶液：0.5 mg/mL牛血清蛋白。
位置浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10～30 mg/mL
3.5.3 实验方法
取7支试管，按下表加入试剂，将试管摇匀，放置20 min。用分光光度计比色测定吸光值A595nm。以A595nm为纵坐标，标准蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
表3-1 考马斯亮蓝测定蛋白质含量标准曲线
考马斯亮蓝测定蛋白质含量标准曲线
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
0.5 mg/mL牛血清蛋白 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
考马斯亮蓝 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
将10个100 mL三角烧瓶分别加入经稀释后的藻液。编号为1和2的两瓶藻样作为控制样参照。标号为3和4的，控制四环素浓度为1 mg/L；标号为5～7的，控制四环素浓度为5 mg/L；标号为8～10的，控制四环素浓度为10 mg/L。分别测定72、144小时吸光度。测定吸光度时，先从100 mL三角烧瓶中取出30 mL，移至烧杯，在细胞破碎仪下破碎10分钟（破碎3秒，停3秒），随后取经破碎的藻液于离心机下离心（3000r/m），取离心后上清液1 mL于10 mL试管中加入5 mL考马斯亮蓝，震荡均匀，并静置20分钟，随后在595 nm下测定吸光度。
3.6 高效液相色谱检测四环素在铜绿微囊藻液中的降解
3.6.1 实验原理
高效液相层析仪根据各种各样的化工互作用力来分离混合物。这种互作用力通常是分析物及分析管柱之间的一种非共价性质。使用高效液相色谱时，液体待检测物在不同的时间被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，每个峰顶都代表一个另外化合物的种类，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。
3.6.2 实验特点
高效液相色谱法有“四高一广”的特点：
（1）高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。
（2）高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
（3）高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。
（4）高灵敏度：紫外检测器可达0.01 ng，进样量在μL数量级。
（5）应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
本实验采用反向分配色谱法，使用C18色谱柱，采用15%:85%（乙腈（色谱纯）：柠檬酸溶液pH约2.95）作为流动相。
图3-2 高效液相色谱法测定四环素在铜绿微囊藻中的降解实验
3.6.3 实验方法
将15个100 mL三角烧瓶分别加入经稀释后的藻液，初始藻密度为1.41×106 个/mL。编号为1～3的3瓶藻样作为控制样参照，不添加抗生素；标号为4～6的，控制四环素浓度为1 mg/L；标号为7～9的，控制四环素浓度为2 mg/L；标号为10～12的，控制四环素浓度为5 mg/L；标号为13～15的，控制四环素浓度为10 mg/L。使用高效液相色谱仪分别测定0、24、48、72、96、120、144小时各藻样四环素的峰面积，绘制藻样中四环素在控制组和各浓度梯度下的降解曲线。
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