木犀草苷对肝癌细胞转移的影响(3)

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of Research Bioresources JCRB, Tokyo, Japan)。

2.3 划痕实验

取对数生长期的Huh-7细胞铺满6孔培养板，然后置于37 oC、5% CO2培养箱常规培养。当细胞浓度超过90%时，将含血清培养基撤去，更换为无血清的培养基进行培养12 h。采用200 µL移液枪头在培养孔中央进行划痕，使之形成的伤口宽度均一，随后用PBS洗去脱落的细胞。然后加入20 µmol·L-1的木犀草苷，同时以不含药物的小组作为对照组，分别在损伤后的0 h、48 h，在显微镜10倍下进行观察，并拍照记录损伤区域处的细胞运动情况。

2.4 Transwell实验

先把小室擦干净后在超净工作台照紫外过夜，将小室倒扣并在小室的底部外侧滴加1%的明胶室温放置20-30 min，调整细胞浓度至5×105 ml-1。拿出24孔板加800 ml含有刺激因子的培养基，37 oC培养。将小室上还未干的明胶甩掉，加细胞放入24孔板里。放入细胞培养箱培养4-6小室。拿出小室甩掉里边的培养基。小心擦尽小室里边的细胞（不能碰外边）。将小室放入装有结晶紫的24孔板染色1 h，最后移到空的24孔板，此时在显微镜下观察。来!自~751论-文|网www.751com.cn

用BD公司的Matrigel 1：8稀释，均匀铺在小室内膜上，置37 oC状态下30 min，使Matrigel聚合成凝胶。取指数生长期的Huh-7细胞，胰酶消化，终止消化后离心除去培养液，用PBS洗3遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105 ml-1，然后进行铺板。在24孔培养板中，每个孔都加入含15%胎牛血清的80 µL RPM1640完全培养基，分别取Huh-7细胞悬液100 µL加入Transwell小室的上室。加入100 µL的木犀草苷（不同浓度），置于37 oC、5% CO2培养箱常规培养24 h。取出小室，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用含20%的甲醇和0.1%结晶紫溶液进行染色30 min，放在倒置显微镜下观察并且拍照，随机选取5个低倍视野进行细胞计数。同类实验重复三次。