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    (3)发酵产酶培养基--MRS液体培养基
    葡萄糖:20.0 g;牛肉膏:10.0 g;酵母膏:5.0 g;大豆蛋白胨:10.0 g;无水乙酸钠:5.0 g;柠檬酸三铵:2.0 g;磷酸氢二钾:2.0 g;硫酸镁:0.58 g;硫酸锰:0.25 g;吐温80:1 mL;去离子水:1000 mL,调节pH值6.4。121℃高压蒸汽灭菌20 min。
    2.1.4 实验设备
    本实验使用的设备见表2.4所示:
    表2.4 实验设备
    设备    厂家    型号
    电子天平    上海精科实业有限公司    MP200B型
    可见分光光度计    上海菁华科技仪器公司    721型
    电热恒温水浴锅    上海恒科仪器有限公司    HWS12
    台式离心机    上海湘仪离心机仪器有限公司    L-530型
    真空干燥箱    上海一恒科技有限公司    DZF_6090型
    低速离心机    上海卢湘仪离心机仪器有限公司    DM-46型
    发酵罐    上海保兴生物设备工程有限公司    2002型
    超净工作台    上海博迅有限公司医疗设备厂    SW-CJ-2FD型
    生化培养箱    上海精宏设备有限公司    SHP-150型
    2.2 实验方法
    2.2.1 亚硝酸钠的测定:盐酸萘乙二胺法
    (1)标准曲线的制作
    本实验采用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸钠的含量,所需配制试剂如下:
    饱和硼砂溶液:称取50.0 g硼酸钠,溶于1000 mL热水中,冷却备用。
    乙酸锌溶液:称取220.0 g乙酸锌,加入30 mL冰乙酸溶于水,并稀释至1000 mL。
    亚铁氰化钾溶液:称106.0 g亚铁氰化钾,用水溶解,并稀释至1000 mL。
    盐酸萘乙二胺溶液:称取0.1 g盐酸萘乙二胺,溶解于50 mL水中,混匀后,置棕色瓶中,避光4℃冰箱内保存,最好现用现配。
    对氨基苯磺酸溶液:称取0.4 g对氨基苯磺酸,溶于100 mL 20﹪盐酸中,置于棕色瓶中混匀,避光保存。
    亚硝酸钠标准溶液:准确称取10g亚硝酸钠,加水溶解移入500 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀。此溶液每毫升相当于20 μg的亚硝酸钠。

    取1mL亚硝酸钠标准溶液,稀释至4mL,此溶液每毫升相当于5.0 μg亚硝酸钠,分别取0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL于50mL的容量瓶中,加入40 mL蒸馏水,摇匀后,分别加入2mL磺胺溶液,摇匀避光3min,分别加入1mL盐酸萘乙二胺,定容后摇匀,避光15min后,538波长下测OD值,汇总数据做亚硝酸钠标准曲线图。
    标准曲线如图2.1 所示
     
    图2.1 亚硝酸钠标准曲线
    由图2.1可以看出,亚硝酸钠标准曲线的相关系数为0.999。
    线性方程:
    A=0.0228×C+0.0024                                    (3.1)
    式中:A—OD538nm
          C—亚硝酸钠溶液浓度(µg/50mL)
    (2)样品测定
    吸取5mL样品置于250mL三角瓶中→加饱和硼砂溶液12.5mL 摇匀→加50mL蒸馏水 沸水浴15min→取出冷却至室温→转入100mL容量瓶→加5mL亚铁氰化钾溶液 混匀→加5mL乙酸锌→定容至100mL 混匀 静置30min 沉淀样品中的蛋白质→取10mL上清液于离心管中 3000r/min离心5min→吸取2mL上清液于50mL容量瓶中→加水40mL 摇匀→滴加2mL对氨基苯磺酸 摇匀 避光3min→加1mL盐酸萘乙二胺 定容至50mL 混匀→避光15min →测538nm下的吸光度。
    样品中亚硝酸盐含量:
    C(µg/mL)=(A-0.0024)×8/0.0228                     (3.2)
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