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摘要：本实验克隆了来源于大肠杆菌JM109的细胞周质空间中表达的磷酸盐结合蛋白（Phosphate binding protein, PBP）编码基因phos。通过重组、转化、酶切、酶连等一系列操作，将phos基因替换重组质粒pTrcHisC-(inpN)3-gfp中的绿色荧光蛋白编码基因gfp，构建了能够展示磷酸盐吸附蛋白的3拷贝InpN串联重复大肠杆菌细胞表面展示体系。最后用磷钼酸比色法测定磷酸盐含量，从而检测构建的重组菌的磷酸盐吸附能力。从检测结果可知，构建的重组菌与对照大肠杆菌JM109相比，有显著的磷酸盐吸附能力。4518
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关键词： 磷酸盐吸附蛋白，大肠杆菌，PCR，重组菌
Cell surface display of phosphate binding protein utilizing tandem repeats of ice nucleation protein
Abstract：In this study, a gene encoding phosphate binding protein (phos) which was expressed in the periplasm was cloned from Escherichia coli JM109. The recombinant plasmid pTrcHisC-(inpN)3-phos was constructed by replacing gene gfp (coding the green fluorescent protein) from the recombinant plasmid pTrcHisC-(inpN)3-gfp using restriction enzyme digestion, ligation and transfomation methods. The phosphate binding protein can be displayed on the bacterial surface utilizing tandem repeats of N-domain of ice nucleation protein. Then, phosphomolybdate colorimetry was used to determine the phosphate binding ability of recombinant strain. According to the results, compared with E. coli JM109, the recombinant strain showed high efficiency of phosphate binding ability.
Keywords: phosphate binding protein, PCR, Escherichia coli, recombinant strain
目录1. 绪论.1
1.1 磷酸盐吸附蛋白的简介1
1.2 本课题研究方法的国内外进展1
1.2.1 除磷的方法2
1.2.2 生物除磷的生化机理分析 ...2
1.2.3 磷酸盐吸附蛋白在其它领域的应用3
1.2.4 生物除磷工艺目前存在的问题和应该如何解决该问题3
1.3 本课题的研究目的和意义...4
1.4 本课题研究的主要内容...4
2. 材料与方法.....5
2.1 实验材料.5
2.1.1 材料与试剂..5
2.1.2 仪器设备..5
2.2 实验方法 ...5
2.2.1 试验流程..5
2.2.2 培养基制备..6
2.2.3 设计简并引物..6
2.2.4 pMB110质粒的提取...6
2.2.5 聚合酶链式反应PCR扩增phos基因...7
2.2.6 琼脂糖凝胶电泳..9
2.2.7 T载体连接...9
2.2.8 大肠杆菌感受态的制备9
2.2.9 酶切、酶连DNA体外重组.10
2.3.0 生长曲线的测定10
2.3.1 绘制磷酸盐标准曲线....10
2.3.2用磷钼酸比色法测定重组菌磷酸盐含量...10
3. 实验结果与分析...12
3.1 phoS基因的克隆和重组质粒的构建12
3.2大肠杆菌重组菌生长曲线测定结果14
3.3 磷酸盐标准曲线.15
3.4 磷酸盐吸附能力分析.16
4. 结论...18
致谢19
参考文献20
1. 绪论
1.1 磷酸盐吸附蛋白的简介
目前，在大肠杆菌中磷酸盐转运系统主要分为可诱导性的高亲和力特殊转运系统“PST系统”（Phosphate-specific transport system）和组成型的低亲和力特殊转运系统“PIT系统”（Phosphate inorganic transport system）二种类型[1]。PST系统[1]是通过可溶性ATPase与特殊的周质镶嵌蛋白偶联，消耗ATP和积聚磷酸盐。PIT系统[1]可能是H+ /Pi共运转的次级运转系统，在缺磷状态下，许多基因参与磷酸盐的吸收和同化，如分别编码碱性磷酸酶、外膜通道蛋白E、磷酸盐链接蛋白和甘油三磷酸偶联蛋白的phoA、phoE和ugpB基因。这些基因组成 pho 操纵子，同时多个调节基因参与调节，从而组成一个复杂的串联调控网络。PST操纵子由一组典型的细胞周质蛋白质组成。一共4个基因编码的蛋白参与了该系统的磷酸盐运输过程，它们是phoS、pstA、pstC和pstB[1]。其中 phoS基因编码的磷酸盐吸附蛋白（PBP）是PST系统磷酸盐吸收运输的关键蛋白，在细胞周质空间中结合磷酸盐并转运至细胞质膜。