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    (1)模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
    (2)模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
    (3)引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
    表1   25μL PCR反应体系
    反应液体系    实验组
    (25μL体系)    阴性对照组
    (25μL体系)
    ddH2O    17.5    17.5
    模板DNA    挑取单菌落JM109    0.0
    上游引物(10μmol/L)    1.0    1.0
    下游引物(10μmol/L)    1.0    1.0
    10×扩增缓冲液    2.5    2.5
    dNTP混合物(10mmol/L)    1    1.0
    Taq酶(5U/μL)    0.5    0.5
    Mg2+    1.5    1.5
    总体积    25    25

    (1)  将反应管放入PCR仪中,按下列条件设好程序,进行PCR反应。
    反应程序:94℃预变性5min
              94℃变性1min
              52℃退火1min      30个循环
              72℃延伸2min
              最后在72℃延伸10min
    (2)  鉴定产物:PCR反应结束(大约3.5h)后,取5μL反应液用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳(用标准Marker: 200bp DNA Ladder),鉴定PCR扩增是否成功以及大小。
    (3)  电泳验证产物后,扩大PCR反应体系至50μL(上述列表中的各项均×2)。

    2.2.6琼脂糖凝胶电泳
    制备0.8%琼脂糖凝胶:称取0.24g琼脂,溶于30ml 1×TAE中,微波溶解后静置,待温度冷却至双手可触摸时,加入1μL EB,倒入胶膜中冷却。
    电泳条件选取:电压110V,电流30mA,时间30min。
    2.2.7 T载体连接
    取1μL T-Vector pMD19(simple),1μL所提phos片段和3μL去离子水,4℃冰箱中过夜连接。
    2.2.8大肠杆菌感受态细胞的制备
    (1)受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli MG1655单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600nm =0.5左右。
    (2)感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) :将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
    (3)转化: 加入pMD-19T-phos载体DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态。 将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
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