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                                                             pTrcHisC- 3inpN-phos
    设计引物           phos            pMD-19T-phos
    2.2.2 培养基制备
    LB培养基的配方如下: 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L ,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L ,氯化钠(NaCl) 10g/L
      另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4(该pH适合目前使用最广的原核表达菌种E.coli的生长)
    LB固体培养基配置  
    (1)配制:100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉   
    (2).氨苄青霉素Amp的加入:高压灭菌后,将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中,待培养基温度降到55℃时(手可触摸)加入抗生素,以免温度过高导致抗生素失效,并充分摇匀。
    抗生素终浓度Amp 100ug/ml,氨苄青霉素加入前已经过滤除菌。

    2.2.3 设计简并引物
    设计简并引物原则:引物长度15-40bp,引物碱基尽可能随机分布(G+C约60%),引物内部链避免二级结构,引物碱基序列不应与非扩增区域有同源性或少于连续8个的互补碱基,引物的3‘端为关键碱基 ,引物长度大于16bp,一般为20-24个核苷酸,引物与靶序列间的Tm值不应过低,引物不应有发夹结构。即不能有4bp以上的回文序列,两引物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列,在3’端不应有任何互补碱基,引物中碱基的分布尽可能均匀,G+C含量接近50%。
    根据从GeneBank上查找到磷酸盐吸附蛋白(phosphate binding protein)编码基因序列,设计用于PCR扩增phos基因引物序列:
    Phos1(上游引物):5'-GGAAGATCTGAAGCAAGCCTGAC-3’  
    Phos2(下游引物):5'-CCGGAATTCTTAGTACAGCGGCT-3'
    引物是PCR扩增必须的,包括保护性碱基,限制性内切酶酶切位点,phos基因序列。是根据多条大肠杆菌phos基因序列分析设计的。

    2.2.4 pMB110质粒的提取
    将包含质粒pMB110的大肠杆菌JM109 在LB液体培养基中培养过夜, 提取pMB110质粒用常规碱法抽提。
    (1).取1.5ml细菌培养物于EP管中,9000rpm离心30秒,弃上清液,使细菌沉淀尽量干燥;
    (2).将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100 µl溶液I (50 mmol/L葡萄糖,10 mmol/L EDTA pH 8.0,25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中,剧烈振荡是沉淀悬浮;
    (3).加入200 µl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH,1%SDS(m/v)),盖紧EP管口,快速颠倒离心管5次,以混合混合物,确保离心管的整个内表面与溶液II接触,不要涡旋,置于冰浴中;
    (4).加入150 µl预冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾,11.5 ml冰乙酸,28.5 ml H2O),盖紧EP管口,反复颠倒数次,使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3~5分钟;
    (5). 12000rpm离心5min,取上清液于另一新EP管;
    (6).用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA,振荡混合于室温放置2分钟,12000rpm离心2分钟;
    (7).小心吸去上清液,将离心管倒置于滤纸上,以使所有液体都流出,在将附于管壁的液滴除尽;
    (8).加1ml 70%乙醇洗涤沉淀,振荡混合,用12,000g离心2分钟,弃上清,将开口的EP管置于室温使乙醇挥发,直至EP管中内没有可见的液体存在(5~10分钟),用适量的ddH2O溶解;
    (9).用0.5µl的RNase 37℃温育5~10分钟;
    (10).电泳鉴定。
    2.2.5  聚合酶链式反应PCR扩增phos基因
    PCR反应原理:PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95度时解旋,55度时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至72度左右,DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。由PCR技术制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在95℃,55℃,72℃之间很好地进行控制。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
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