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    ,对人类认识植物起到了促进作用,为改良植物性状、创造更符合人类
    需求的植物提供了理论支持和技术借鉴。
    基因组编辑技术是基因功能研究的较好手段,而高效率、高特异、较灵活的
    CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated
    systems)系统更是可以广泛应用于基因功能研究,通过敲除基因进而为基因功能研究给
    出最直接的证据。另外,CRISPR/Cas9 系统是基因组水平的编辑,与 RNAi 相较,又具
    有完全敲除表达、可遗传的优势[3]。特别是用于关键基因功能研究的单基因完全敲除,
    通过设计替换sg RNA,基本上所有的基因都可以被敲除[4],实现对其功能的研究。 CRISPR/Cas9 是一种广泛存在于细菌和古生菌的适应性病毒防御系统。在自然界
    中,当病毒侵入这些原核生物个体时,CRISPR 系统表达 Cas 蛋白和与病毒基因组互补
    的guide RNA,guide RNA引导Cas 蛋白结合到对应病毒基因组切割 DNA,进而抑制病
    毒,从而起到防御作用[5]。 在自然界 CRISPR/Cas9 系统的基础上,众多研究团队对 CRISPR/Cas9 系统进行了
    改造,现今最为广泛应用的是将 cr  RNA 和 tracr  RNA 融合改造形成的 chimeric single
    guide RNA(sg RNA)CRISPR/Cas9 体系拟南芥作为生长周期短的模式植物,按照以前研究的结果,通过基因组编辑技术获
    得纯合突变体至少也需要 3 个完整的世代。CRISPR/Cas9 系统含有转录后相互独立的
    Cas9 核酸酶和决定编辑特异性的 sg RNA。所以在基因/位点敲除方面, CRISPR/Cas9  系
    统将具有其他任何基因组编辑技术无以比拟的绝对优势[7]。
    本实验室其中一个研究课题是探索 CRWN3 蛋白调控拟南芥基因组 DNA 甲基化模式
    的分子机理,因 CRWN 家族有四个成员,即 CRWN1、CRWN2、CRWN3、CRWN4,它
    们都被认为是核片层蛋白的重要组成成分[8],因此需构建CRWN 基因的突变体,以真正
    理解它的功能,而本课题为利用 CRISPR/Cas9 系统构建 CRWN3 的单突变,CRWN3 为
    AT1G68790。
    1  材料与方法 
    1.1  实验材料
    1.1.1 拟南芥材料    
    拟南芥野生型种子(Columbia ecotype,Col)为本实验室保存。
    1.1.2 实验菌株    
    大肠杆菌  (Escherichia coli)  菌株DH5α由本实验室保存;
    农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株  GV3101  由本实验室保存。
    1.1.3 克隆载体
    大肠杆菌 AtU6-26SK;
    大肠杆菌 35S-CAS9-SK;
    植物表达载体 Pcambia 1300。
    1.1.4 实验仪器设备
    PCR 扩增仪(Bio-Rad),恒温摇床,恒温培养箱,低温高速离心机(日立),超净工作
    台,-80  ℃冷冻冰箱,-20 ℃冷冻冰箱,4 ℃冰箱,电泳仪,分析天平,分光光度计,
    微量移液器,pH计等。 1.1.5 实验培养基和试剂的配制
    (1)MS 培养基(1 L):将 800 mL左右的 ddH2O置于1 L烧杯中,加入 4.43 g MS 粉
    和20 g蔗糖,充分搅拌,定容至 1 L,用 0.5 M NaOH调节溶液 pH 为5.80-5.85之间,
    加入7.3 %的琼脂粉后,进行 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min。灭菌后待冷却到约 60 ℃时
    倒皿。
    (2)营养土的配制:将蛭石与黑土以一定比例(本实验室采用约 4:1 的比例)混合,
    充分搅拌混匀后,放置在 100 ℃烘箱中烘 4 h,放置冷却后再使用。
    (3)1 M Tris-Cl 缓冲液(pH 8.0,1 L):取121 g Tris 置于烧杯中,加入约 700 mL去
    离子水,充分搅拌后发现 Tris 不溶解,需要加入浓 HCl,同时调 pH到8.0后定容至 1 L,
    分装后高压灭菌。
    (4)0.5 M EDTA 溶液(pH 8.0,1 L):将 186.1 g Na2EDTA·2 H2O加入到约 800 mL
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