去离子水中,搅拌混匀,用 NaOH调pH到8.0 后定容至1 L,分装后高压灭菌。
(5)DNA提取缓冲液:分别取 100 mL 1 M Tris-Cl(pH 8.0) 溶液,40 mL0.5 M EDTA
(pH 8.0)溶液加入到约 500 mL的去离子水中,加入 81.8 g NaCl 固体,20 g CTAB,加热
搅拌,充分溶解后定容至 1 L,分装高压灭菌。
(6)TAE电泳缓冲液(50×,1 L):取 242 g Tris 和37.2 g Na2EDTA·2 H2O加入约
600 mL去离子水中,充分溶解后,加入 57.1 mL冰醋酸,定容至 1 L。
(7)DNA上样缓冲液(1 L):称取固体 Na2EDTA·2 H2O 11.23g后加入约 400 mL去
离子水中,加热0.5 g溴酚蓝搅拌至充分溶解后,加入 360 mL甘油并用 2 M NaOH调
pH到7.0 后定容至 1 L,室温保存。
(8)10×PCR buffer(50 mL):将20 mL的1 M Tris-Cl(pH 8.0)溶液,将其 pH到调
8.4,取其中 10 mL放入25 mL去离子水中,加入 1.864 g KCl 和 0.203 g MgCl2·6H2O,
溶解后定容至50 mL,高压灭菌,4 ℃保存。
1.2 实验方法
1.2.1 植物材料的培养
(1)种子的消毒与幼苗的培养
首先将拟南芥Col-0种子里面的杂质去除干净,然后用8 % NaClO消毒拟南芥种子,
消毒的过程中可用涡旋震荡仪使其充分消毒,8 min后在超净台里用无菌水清洗,之后
可在MS 培养基上点种,点种完毕后用医用胶带封口置于 4 ℃冰箱,2 d后放入人工智
能气候室中培养,培养条件为 16 h光照/8 h黑暗、100 Μm-2
S-1
光照强度、恒温 22 ℃及
70-80 %的相对湿度。
(2)材料的种植
将培养皿中生长 10-14 d的幼苗移到装有已灭菌的营养土中,每小盆移 9株苗,之
后用保鲜膜覆盖,于 18-22 ℃、16 h光照/8 h黑暗和100 Μm-2
S-1
光照强度的人工智能
气候室中培养,4-5 d后可以将保鲜膜去掉,使植物正常生长。
1.2.2 设计sg RNA
设计 sg RNA的方法如下:
(1)在tair网站(拟南芥资源信息网站)寻找并下载拟南芥 CRWN3 基因序列;
(2)在 snapgene 中打开(1)所下载的 CRWN3 基因序列,标出该基因外显子与内含子;
(3)使用 snapgene 选择合适的sg RNA,合适的sg RNA应满足以下条件:序列满足
G+19N+NGG;序列 NGG前面2-8个bp 有酶切位点,且酶切位点所需用的酶为常用酶,
酶切范围越大越好(本课题采用的常用酶为HindⅢ) ;sg RNA越靠近起始密码子越好。
1.2.3 构建载体
(1)在 sg RNA 识别序列(不含有 PAM序列)加上用于构建克隆的接头列(针对
本体系用的AtU6 启动子,此处我们在有义链 5’ 端加上5’-GATT-3’接头,在无义链 5’
端加上5’-CAAA-3’接头),合成引物。将合成的正反向引物退火形成含有粘性末端接头
的双链核苷酸,退火体系为:
oligo 1 (10 µM) 5 uL
oligo 2 (10 µM) 5 uL
10 ul total
使用以下参数在PCR仪中进行退火:
37 ℃ 30 min
95 ℃ 5 min
4 ℃ at the end
(2)按如下体系用 BbsI酶切骨架载体 AtU6-26SK:
cutsmart 2 uL
BbsⅠ 1 uL
质粒 8 uL
ddH2O 9 uL
37 ℃酶解 3 h
酶切产物经1 %琼脂糖电泳后,采用Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒,
参照试剂盒说明书回收片段:
①取 1.5 mL 离心管,称重,标记;用干净的小刀在紫外等下切割尽量小的含有目
的DNA的胶块,放入离心管中,再次称重,求得胶块净重;
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