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摘要：microRNA是一种非编码RNA分子，长度约21~22个核苷酸，可以通过与靶mRNA结合调节基因的转录后表达。Drosha是一种核糖核酸酶，在microRNA的表达中起着修饰miRNA初级转录产物的作用。根据现有的研究结果可以知道，Drosha能够切割miRNA的初级转录产物pri-miRNA，却不清楚具体的修饰机制。为了进一步研究microRNA的修饰机理，本实验以人的293T细胞为实验材料，利用载体连接、转化、菌落PCR、核酸电泳、Quick Change、细胞转染、蛋白印迹等试验方法，进行Drosophila Drosha的克隆与表达，为后续实验研究奠定基础。26202
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毕业论文关键词：microRNA；Drosha；基因克隆；蛋白表达
Clone and Expression of Drosophila Drosha
Abstract：microRNA is a noncoding RNA with a length of about 21 to 22 nucleotides. It can control the expression of gene by combining with the target mRNA. Dorsha is a kind of RNase, which can modifies the primary production of miRNA transcription. According to current research, Drosha is able to cut pri-miRNA, the primary product of miRNA, but the specific modification mechanism is not clear yet. In order to study the mechanism furtherm we cloned Drosophila Drosha using ligation, transformation, colony PCR, DNA electrophoresis, Quick Change, cell transfection and Western Blot methods, and expressed this protein in human 293T cell.
Key words: microRNA；Drosha；gene cloning；protein expression
目 录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 待插入的基因片段.2
1.1.2 载体.2
1.1.3 感受态细胞2
1.1.4 细胞2
1.1.5 引物2
1.2 实验方法 2
1.2.1 质粒提取2
1.2.2 制备感受态细胞2
1.2.3 连接3
1.2.4 转化3
1.2.5 菌落PCR.3
1.2.6 核酸电泳3
1.2.7 切胶回收.3
1.2.8 Quick Change.3
1.2.9 Blast4
1.2.10 转染.4
1.2.11 Western Blot.4
2 结果与分析4
2.1 Drosophila Drosha的克隆4
2.1.1 分段克隆Drosha基因片段.4
2.1.2 连接及构建Drosha基因片段5
2.1.3 Quick Change7
2.1.4 将Drosha片段克隆到pTOPO载体上8
2.2 Drosophila Drosha的表达10
3 讨论 10
致谢11
参考文献12
附录.12
Drosophila Drosha的克隆与表达
引言小RNA分子是非编码的RNA分子（noncoding RNA, ncRNA），其控制着真核细胞的许多功能，影响基因表达、细胞周期和个体发育等多种行为[1,2]。miRNA是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，长度约21~22个核苷酸（少数小于20个核苷酸），能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调控[3]。miRNA由一段具有发夹环结构的长度为70~80个核苷酸的miRNA前体（pre-miRNA）剪切后生成。它通过与其目标mRNA分子的3端非编码区域（3’-untranslatedregion，3UTR）互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制[4,5]。
Drosha是一种核糖核酸酶，miRNA的初级转录产物pri-miRNA在细胞核中被一种蛋白复合体切割成为前体miRNA（pre-miRNA），而Drosha就是这种蛋白质复合体的主要组成部分。被Drosha切割后的miRNA再由另一种核糖核酸酶Dicer加工，最后形成成熟的miRNA。
果蝇是一种重要的模式生物，常被应用在miRNA的研究中。本实验就是以人的293T细胞为实验材料、以果蝇的Drosha基因为研究对象，构建并表达Drosophila Drosha基因，为后期进一步研究miRNA的合成机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 待插入的基因片段
实验室中已构建的pTOPO-Drosha质粒，但仍有突变点。
1.1.2 载体
1.1.2.1 克隆载体