转染是将DNA片段插入细胞或细胞系的过程。本实验中利用转染的技术,将构建好的pTOPO-Drosophila Drosha基因转入293T细胞中,以检测该基因是否能够正常表达。转染试剂为Invitrogen公司的Lipofectamine 2000 Transfection Reagent。实验中,将DNA加入50μl无血清的DMEM培养基中,将1μl的lipo2000加入50μl无血清的DMEM培养基中混匀,室温下放置20min,一滴一滴加入细胞培养液。37℃恒温无菌培养箱中培养48h后提取蛋白。
1.2.11 Western Blot
培养好的细胞用PBS清洗后加入NETN裂解液,离心取上清;清洗SDS-PAGE电泳槽,加入配置好的分离胶和浓缩胶,插入梳齿;待胶凝固后拔下梳齿,加入缓冲液,点样;当溴酚蓝刚跑出时即可停止电泳,将胶小心取下,放入浸泡在缓冲液中的NC膜上,中间用滤纸隔开,排气泡,扣上转移槽上盖,用400mA电流转膜35min;将NC膜取出,用去离子水清洗,浸入丽春红染色5-10min,再用去离子水清洗2-3次;将3g脱脂奶粉加入30ml TBST(1×)溶液中混匀,让NC膜完全浸泡在脱脂奶粉溶液中10-15min,用TBST(1×)溶液清洗三次NC膜,每次5min;覆一抗αFlag和αactin 1-1.5h,用TBST(1×)溶液清洗三次NC膜,每次5min;覆二抗AP标记1h,用TBST(1×)溶液清洗三次NC膜,每次5min;用去离子水清洗NC膜,选用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色法显现出蛋白条带。
2 结果与分析
本实验共分为两个部分。第一个部分为Drosophila Drosha的克隆:将带有突变的Drosha分片段设计引物并克隆出正确的序列,连接到克隆载体上测序;确定序列正确后,用PCR手段将Drosha片段合成一个整体,并连接到表达载体PTOPO上得到完整的Drosophila Drosha克隆。第二个部分为Drosophila Drosha的表达:将克隆完成的Drosophila Drosha基因转入人的293T细胞进行表达,用Western Blot确定蛋白表达成功。
2.1 Drosophila Drosha的克隆
本实验中Drosophila Drosha的克隆根据载体的类型共分为两个阶段。第一阶段的实验目标为将几个短的基因片段通过PCR的方式连接到一起,因此选用了克隆效率高的TA载体作为克隆载体;第二阶段的实验目的为Drosophila Drosha蛋白表达的准备,因此选用了具有完整启动子和终止子的载体pTOPO作为表达载体。
2.1.1 分段克隆Drosha基因片段
本实验的实验材料为实验室以前构建好的但是仍然带有突变的Drosha基因,且Drosha基因较长,因此我们采用分段克隆Drosha基因片段的方式将突变修复。本实验采用分段修复的方法,第一步将450bp左右大小的Drosha片段(片段1)与270bp左右大小的Drosha片段(片段2)进行连接,成为700bp左右大小的Drosha片段(片段3)。通过核酸电泳和基因测序来验证所得片段是否正确。电泳结果见图2.1.1,由图可知,PCR结果为700bp左右的核酸片段(片段3),序列见附录2,经过Blast鉴定,片段3为Drosophila Drosha。
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