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    1.2.4  转化   
    往连接混合溶液中加入40-50μl感受态细胞,冰上放置15min,42℃热激40s,立即冰浴2min;加入150-200μl LB液体培养基,37℃恒温摇床中培养45min-1h,缓慢将菌液滴入37℃预热后的固体LB培养基上,取灭菌后的玻璃珠均匀涂板,至培养基表面无明显液体残留;37℃温箱培养16h。
    1.2.5  菌落PCR   
    在无菌环境下挑取多个重复(一般选5-10个克隆作为一组重复),每一个克隆都用一定量的无菌水稀释;取灭菌后的PCR管,将菌液、PCR buffer和两种引物(根据特定的PCR反应确定buffer和引物的类型和用量)按照特定实验中的比例加入到准备好的PCR管中,设置好阴性对照(根据核酸电泳结果可以判断试剂中是否存在核酸污染),放入PCR仪中进行PCR反应。
    1.2.6  核酸电泳   
    配置1.2%的核酸胶,称取0.4g琼脂糖粉末倒入制胶的专用瓶中,加入35ml TAE buffer(1×),放入微波炉中加热至胶溶液无色透明;将胶槽洗净,根据具体的实验需要插入相应的梳齿;将胶放置在微波炉外冷却,至不烫手时加入2μl EB,混匀,沿着胶槽壁缓慢倒入胶槽中,使得胶体没过梳齿下沿且胶体与胶槽之间没有气泡,冷却至胶体凝结为固体;将marker(视具体核酸大小而定)、PCR产物依次加入点样孔中,进行电泳;电泳结束后,在紫外凝胶观察仪下观察结果。
    1.2.7  切胶回收   
    本实验使用BIOMIGA公司的Gel/PCR Extraction Kit进行切胶回收。从凝胶上切下带有目的片段的凝胶块到一个1.5ml或2ml的离心管中,加入1倍体积的Buffer GC(称量或者估算凝胶的重量,确保加入不少于1倍体积的Buffer GC),置于55℃~60℃水浴中加热8~10分钟,期间颠倒混匀几次,直至凝胶块完全溶化,冷却离心管至室温;转移以上混合液(每次不超过700μl)至一个带有收集管的吸附柱中,室温下13,000xg离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回到收集管中,重复,直至剩余的混合液全部通过吸附柱;加入500μl DNA Wash Buffer至吸附柱中,室温13,000xg离心30s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回到收集管中,重复1次;室温13,000xg将吸附柱开盖离心2min,去除残留的乙醇。
    1.2.8  Quick Change   
    Quick Change即定点突变技术,是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组,也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化),包括碱基的添加、删除、点突变等。本实验的Quick Change按照Agilent Technologies公司的QuickChange Ⅱ Site-Directed Mutagenesis Kit试剂盒操作,该试剂工作的原理是:第一步是用标准的引物大量扩增,以及由Q5热启动高保真DNA聚合酶的混合;第二步是培育一种含有激酶、配体酶和DpnI的酶,这些酶一起使PCR产物快速循环,并将模板移除;最后一步再高效转化到感受态细胞中。操作步骤如下:在未修改核苷酸序列的两侧合成两条包含所需突变的互补核苷酸链;按照试剂盒中标注的体积加入缓冲液、DNA模板、两对引物、游离的脱氧核苷酸和去离子水,分别准备对照组和实验组;进行PCR循环,第一个循环设定为95℃30s,循环一次;之后进入95℃30s、55℃1min、68℃1.5min,12个循环;将反应体系放置在冰上2min,使反应冷却到37℃。
    1.2.9  Blast   
    Blast是一种基因分析技术,克隆完成的DNA拿去测序公司测序后会得到一长串的测序结果,将测序结果拿到分析网站基因库上进行blast,就可以得出实验中克隆的是哪种基因,以及它和其它种属之间的亲缘关系。
    1.2.10  转染   
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