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    本实验采用的克隆载体为TaKaRa公司的T-Vector pMD19(simple)。它是两侧的3’端添加了“T”的线性化载体,因为大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性。因此,pMD19和基因片段连接很容易,转化效率也很高,适合作为克隆载体。
    1.1.2.2 表达载体   
    本实验采用的表达载体为艾德莱公司的拓扑异构酶载体pTOPO-T simple Vector。它与传统的T4连接酶原理不同,利用了Topoisomerase可以在瞬间(几秒钟-几分钟)、高效(接近100%)连接DNA片段的原理制成。转化效率没有TA载体高,但具有完整的启动子和终止子,故选作表达载体。
    1.1.3  感受态细胞   
    本实验中采用的感受态细胞为E.coli。
    1.1.4  细胞   
    本实验采用的细胞为人的293T细胞。293T细胞源自于293细胞株,是插入了猿类免疫缺陷病毒SV40大T抗原基因后产生的高转染效率的衍生株,该细胞经过了检测,不含有细菌、真菌、病毒(HIV、HBV、HCV)、支原体。该细胞在37℃、5%CO2、无菌恒温培养箱的条件下培养。293T细胞的增殖能力取决于培养技术、培养条件等综合因素。
    1.1.5  引物   
    本实验中用到的引物一共有三对,分别是A77-Q88-5’(生工)、A77-Q88-3’(生工),Hind3-dDrosha-5’(Invitrogen)、shaP210-T221-3’(生工),T221-K-230-5’(生工)、a-BsmBⅠ1410-3’(生工)。引物序列见附录1。
    1.2  实验方法
    1.2.1  质粒提取   
    本实验中的质粒提取采用BIOMIGA公司的质粒提取试剂盒Plasmid Miniprep Kit提取质粒。用标准LB(Luria Bertani)培养基培养大肠杆菌12-16h至菌液OD600(细菌密度)值在2.0-3.0之间,取5ml菌液于12ml细胞管中,室温4000rpm离心5min,弃上清;往沉淀中加入250μl含RNase A的 Buffer A1,涡流震荡悬浮细胞,转入2.5ml离心管中;加入250μl Buffer B1,轻轻地反转10次以混合均匀,静置5min至溶液粘稠而澄清;加入350μl预冷后的 Buffer N1,立即反转多次至溶液充分混匀,此时出现白色絮状沉淀,室温下13,000rpm离心10min至沉淀完全;小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA柱中(避免吸起沉淀),室温13,000rpm离心1min,弃废液,将离心柱重新放回到收集管中;向离心柱中加入500μl 含无水乙醇DNA Wash Buffer,室温13,000rpm离心1min,弃废液,将离心柱重新放回到收集管中,重复1次;13,000rpm室温开盖离心5-10min以彻底去除残留的乙醇;将离心柱转至一个新的1.5ml离心管中,向DNA柱中加入70μl Elution Buffer,室温放置2min,13,000rpm离心1min,洗脱质粒DNA。将洗脱液再次加入到柱中,13,000rpm离心1min,收集洗脱液。
    1.2.2  制备感受态细胞   
    将大肠杆菌接入3ml LB液体培养基,37℃恒温摇床中以180rpm的转速摇过夜;转入150ml LB培养基中37℃转化2h;当菌液的OD600达到0.5左右时,将菌液分装进4个50ml的离心管中;将离心机的温度调节到4℃,4000rpm离心10min,抽去上清留沉淀;每管中加入7ml 0.1M的MgCl2溶液,混合均匀,冰上放置15min,合成一管;将离心机的温度调节到4℃,4000rpm离心10min,抽去上清留沉淀;加入5ml 0.1M的CaCl2溶液,混合均匀,转入15ml的离心管中,冰上放置1h,每15min混匀一次;加入70%甘油至终浓度为15%,分装到1.5ml的离心管中,-80℃保存。
    1.2.3  连接   
    往灭过菌的1.5ml离心管中加入0.5μl载体(pMD19或pTOPO-T simple Vector)、5μl 2×Ligation Mix、4.5μl 待连接的DNA片段,在振荡器上混匀,轻轻离心使离心管盖上和管壁上的溶液全部落入管底,室温放置30min。
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