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摘 要：本文基于双链DNA为模板合成铜纳米颗粒具有荧光特性的原理，并以此做信号输出实现对DNA聚合酶活性的非标荧光检测。DNA发夹引物自身不能合成铜纳米颗粒，荧光较弱。目标DNA聚合酶诱导发夹引物的聚合延伸形成双链DNA产物，并以此为模板合成铜纳米颗粒，荧光显著增强。荧光强度与DNA聚合酶的浓度呈正比，检测荧光强度的变化实现对DNA聚合酶活性的检测。该方法原理简单，可操作性强且无需荧光基团标记，可推广适用于其他核酸修饰酶的检测。28281
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毕业论文关键词：DNA聚合酶；铜纳米颗粒；DNA发夹引物；荧光检测
Double-Strand DNA-Templated Formation of Copper Nanoparticles as Fluorescent Probe for Label-free Detection of DNA Polymerase
Abstract:In this paper，we construct a label-free fluorescent assay for DNA polymerase based on the principle of double-strand DNA-templated formation of copper nanoparticles (Cu NPs)，which can give fluorescence emission and be taken as signal readout．DNA hairpin primer (HP) cannot be taken as template for the formation of Cu NPs，and thus obtain a weak fluorescence．DNA polymerase can trigger the polymerization extension of HP and produce a double-stranded DNA (dsDNA)，which then can be taken as the template for the formation of Cu NPs，and give a strong fluorescence signal．Fluorescence intensity is proportional to the concentration of DNA polymerase，and the detection of DNA polymerase can be realized by monitoring the changes of fluorescence intensity．The proposed method is simple，easy to operate and label free，it can be applied in the detection of other DNA modified enzymes．
Key words:DNA polymerase；Copper nanoparticles；DNA hairpin primer；Fluorescence detection
目 录
摘 要 1
引 言 1
1 实验部分 3
1.1 实验仪器 3
1.2 实验药品和试剂 3
1.3 实验步骤 4
2 结果与讨论 4
2.1 实验原理与DNA探针设计 4
2.2 实验原理验证 5
2.3 实验条件考察 5
2.4 DNA聚合酶活性的检测性能 7
3 结 论 8
参考文献 8
致 谢 11
基于双链DNA为模板合成铜纳米颗粒用于DNA聚合酶的非标荧光检测
引 言
DNA聚合酶可以以单链DNA为模板，催化底物dNTPs合成双链结构。最早发现的DNA聚合酶是在大肠杆菌中，随着科学研究范围的不断扩大，在微生物和很多其它的原核生物中也相继被找到。迄今为止，被测序和克隆的DNA聚合酶相关基因有100多种[1]。作为一种重要的工具酶，DNA聚合酶在生命过程中发挥着核心作用，特别是在DNA复制和修复过程中，并据此在一些过度增殖性疾病，如癌症，有针对性的治疗。当然，它也在基因测序、基因克隆及载体制备等各种分子生物学技术之中得到非常广泛的应用[2]，并且已经作为观察疗效以及诊断肿瘤的有效方法[3]，其活性检测对人类的肿瘤等疾病的诊断和治疗效果的考察具有重大的意义[4]。DNA聚合酶已经成为多种疾病药物研究开发的重要靶标[5,6]，有希望成为重要的肿瘤标记物。放射性同位素标记结合凝胶电泳[7]是DNA聚合酶研究的传统方法。这些方法操作费时费力，且对人体有一定的危害。在过去的几十年中，非放射性DNA聚合酶检测得到了快速的发展。比如，PCR法[8,9]，荧光标记的dNTP法[10]，双链DNA定量染料[11]法，基于荧光共振能量转移的DNA探针[12]和分子信标(MB)[13]。与放射性检测相比，基于荧光的方法有几个优点，包括操作简单、无辐射、响应速度快，通用性等。然而，现有的基于荧光的DNA聚合酶检测方法仍有一些缺点，比如，试剂非常昂贵和需要对模板序列进行特别的设计等等。比如标记dNTP的方法，因为需要荧光标记聚合酶反应的底物，实验成本很高。PCR法虽然能够研究耐高温聚合酶在各个时间点的活性，但是不能很好地分析不耐高温的聚合酶的活性。另外，Tveit[14]报道了应用染料Picogreen来检测聚合酶活性的方法，该方法不需要对底物进行荧光标记，但是染料的成本非常高，并且使用的是利用终点测定来研究DNA聚合酶的活性，不能在各个时间点得到聚合过程和聚合酶活性的信息。这些缺点都限制了其广泛的应用。因此，发展低成本、高灵敏度和特异性好的DNA聚合酶活性的检测新方法具有十分重要的意义。
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