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1.2.3 引物设计与合成
用于扩增圆环病毒2型全基因组序列的引物引用自LiLimin等[21]，同时根据M. Vlasakova等[23]设计了3对重叠的引物来获1767bp全长片段。本研究 PCV2M1/M2(460bp)鉴定引物，扩增PCV2 ORF2基因的引物为本实验室设计和保存，见表1-1。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1-1 PCV检测引物和扩增全序列引物
Table 1-1 Primer sequences designed for detecting PCV2 and amplifying PCV2 whole genome
反应类型/引物序列
Type of reaction/ Primer sequence（5′→3′） 退火温度/℃ 产物长度/bp
Annealing temperature Product length
扩增PCV2 ORF2基因
PCV2M1 5’- AGAAGGGCTGGGTTATG-3’ 50.3 460
PCV2M2 5’-TATCCAAGGAGGCGTTAC-3’ 50.7
扩增PCV2 全长基因
PCV2-F 5’- GCTGGCTGAACTTTTGAAAGT -3’ 48 1767
PCV2-R 5’-AAATTTCTGACAAACGTTACA -3’
PC1 5’-GAGAAAGCGAAAGGAACAG-3’ 55 1140
PC2R 5’-GAAAGGTTAAGGTTGAATTCTG-3
PC3 5’-GTTGGAAGTAATCAATAGTGG-3’ 55 976
PC4R 5’-CAGCAGTAGACAGGTCAC-3’
PC5 5’-TGTTCACTCTGAATAATCCTTC-3’ 55 638
PC6R 5’-ACACAGTCTCAGTAGATCATC-3’
1.2.4样品中PCV2的检测
将上述提取的样品DNA模板进行PCV2的ORF2基因扩增。PCV2检测用的上下游引物PCV2M1/M2（10μmol•L-1）各1μL，Mix 12.5μL，加入2.5μL提取的病毒核酸，加入灭菌双蒸水至25μL，PCR循环条件为：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，30循环，72℃ 10min，16℃保存。当PCR结束后在1%的琼脂糖胶上进行电泳，在紫外灯下成像。若条带大小为460bp，则为PCV2阳性。将阳性DNA样品放-20℃保存备用。
1.2.5 阳性样品PCV2全序列的扩增与PCR产物回收
在鉴定为PCV2阳性的部分样品中，选取条带较亮样品的DNA作为模板，用全长引物或重叠引物进行全序列的扩增。PCR扩增反应体系为50μL，反应成分如下：上下游引物P1/P2各2μL、10×dNTP 1μL、10×HiFi Buffer 5μL、50mμMgSO4 3μL、DNA模板 3μL、Platinum Taq HiFi酶0.5μL(5 U/μL)，用灭菌双蒸水补齐使总体积达到50μL。PCR进行程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸2min，共进行32个循环；然后68℃延伸5min，置4℃保存。PCR结束后在1%的琼脂糖胶上进行电泳，参照TaKaRa PCR产物纯化试剂盒说明，将阳性扩增条带进行纯化。将PCR产物加入5倍体积的Buffer CP，涡旋混合均匀，瞬时离心，将溶液收集到底部。转移以上混合液至一个带有收集管的吸附柱中，室温下，10000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中。加入700μL DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，1000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中，并重复该步骤一次。室温下，10000g，将吸附柱开盖离心2min，去除残留的乙醇。转移吸附柱至1.5ml收集管中，加入45μL 60℃ 预热的Elution Buffer至吸附柱膜中央，室温放置2min，13000g离心1min，得到PCR回收产物。
1.2.6 目的基因连接
将回收产物与pMD19-T载体连接，连接反应体系为：回收的PCR产物4.5μL，Solution I 5μL，pMD19-T载体0.5μL，总共10μL，16℃连接过夜。
1.2.7 感受态制备