取DH5α甘油菌10μL至LB液体培养基中,37℃摇床培养16h;第二日取新鲜大肠杆菌DH5α 200μL至LB液体培养基中,37℃摇床培养至OD值0.6;取出冰浴5min;吸1.5mL至EP管,4℃,3800rpm,离心5min;弃上清,使残液流尽,加冰预冷的0.1M CaCl2 500μL重悬菌体,用枪头轻吹混匀;冰浴30min,4℃,3800rpm,离心5min;弃上清,留沉淀,置冰中,加预冷200ulCaCl2重悬菌体,轻吹混匀,置4℃,2h后可用。
1.2.8 PCV2全长序列的克隆与鉴定
将10μL连接产物加至制备的DH5α感受态菌,轻轻混匀,水浴30min;42℃热休克90s,冰浴5min;在超净台内加800μL LB液体培养基混匀,37℃摇床培养2h;4℃,5200rpm,离心5min,弃800μL上清,留200μL上清来重悬菌体,用三角玻棒均匀涂布于氨苄平板培养基,37℃恒温箱培养。
在37℃培养12~16h后,挑取白色单菌落接种于1mL含Amp的液体LB培养基中,37℃振荡培养3h,然后做菌落PCR鉴定。PCR扩增反应体系为25μL,反应成分如下:上下游引物P1/P2各1μL、dNTP 2 μL、10×Buffer 2.5μL、菌液 2.5μL、LA Taq酶0.5μL(5U/μL),用灭菌双蒸水补齐使总体积达到25μL。PCR循环条件为:94℃ 5 min;94℃ 1min,56℃ 1min,72℃ 1min,30循环,72℃ 10 min,16℃保存。菌落PCR阳性的菌将菌液接种5 mL含Amp的液体LB培养基培养过夜后,参照TaKaRa质粒DNA提取试剂盒说明书提取质粒。将质粒用限制性内切酶EcoR I和HindⅢ进行阳性重组子的双酶切鉴定,体系为20μL:10× Buffer 2μL,EcoR I 1μL,HandIII 1μL,质粒1μL,ddH2O 15μL,37℃水浴3h 。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,出现大小约1767bp或1768bp条带的质粒为阳性。
1.2.9序列测定与分析
将菌落PCR为阳性的菌液,一份保存于15%灭菌甘油里,另外一份送去测序。测序结果和GenBank中选取的参考毒株序列用DNAStar软件进行分析,比较各PCV2分离株和已发表的PCV2全长基因序列的同源性,并将序列上传于GenBank,获取基因号。将本实验分离得到的12株序列与本实验室2010-2012年分离的37株序列,GenBank上下载的13株2013-2014年间我国华东地区的序列(表1-2)以及25株世界各国和地区已经确定亚型的参考毒株全基因序列(表1-3),使用Mega5.0软件通过邻并法(Neighbor-Joining,NJ)进行遗传进化分析,同时将这些毒株的ORF2基因序列进行遗传进化分析,并生成系统进化树。
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