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表1 葡萄糖浓度与吸光度的关系
葡萄糖浓度
C（μg/mL） 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
吸光度A 0 0.036 0.147 0.165 0.286 0.341 0.404 0.491 0.566 0.641
图1 葡萄糖标准曲线
1.2.4怀牛膝茎叶多糖提取率的测定
从不同提取方法的粗提取液中各取出1 mL，定容于1000 mL的容量瓶里。摇匀，再各取出1 mL置于10 mL的试管中，各加入6%的苯酚溶液1.00 mL，摇匀，依次加入98%的浓硫酸5 mL，摇匀，静止15 min后，置于40 ℃的条件下30 min，冷却，于波长490 nm处测定吸光度。根据回归方程算出测量多糖的C（μg/mL），按照以下公式计算提取物多糖的提取率（mg/g）。
多糖的提取率（mg/g）=CVK×10-3/W
式中：C-测量液多糖的浓度（µg/mL）；
V-粗糖提取液的体积（mL）；
K-为粗糖提取液稀释的倍数；
W-原料的干重（g）。
1.3怀牛膝茎叶多糖提取液的抑菌活性
1.3.1培养基的制备
大肠杆菌培养基：牛肉膏2.5 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 2.5 g，琼脂8.5 g，500 mL蒸馏水，PH7.0-7.2，121 ℃灭菌30 min。
农杆菌培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母浸粉1.0 g，蔗糖5.0 g，MgSO4•7H2O 4.0 g，琼脂15.0 g，PH7.2-7.6，121 ℃灭菌30 min。
1.3.2活化菌种
在无菌工作台上把低温保存的菌种用移液管吸取一定量的放入灭菌好的液体培养基里，把锥形瓶放在恒温摇床上过夜增殖。过夜增殖菌种时，恒温摇床要在一定的设定范围工作，增殖大肠杆菌时恒温摇床的转速设定为180 r/min，温度为37 ℃。增殖农杆菌时恒温摇床的转速设定为180 r/min，温度为28 ℃。
1.3.3抑菌液的制备
取适量的怀牛膝茎叶多糖和蒸馏水放于小烧杯中，于紫外灯光下灭菌40 min。然后取滤纸片在上述溶液中浸泡一定时间。
1.3.4实验操作
将灭菌好的固体培养基倒入无菌培养皿中，水平放置待凝固。用无菌吸管吸取0.3 mL-0.5 mL菌悬液加入到凝固的培养皿上，用无菌三角涂布棒涂布均匀。将涂布好的培养皿分成3等分，作上标记（在培养皿的下面用记号笔做标记）。用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片置于每个培养皿对应的部位，一个用无菌水对照，另外两个为不同方法的多糖提取液。每个菌种做四个重复，和一个空白对照。大肠杆菌、农杆菌放于分别置于37 ℃、28 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察是否产生抑菌圈，并测量抑菌圈的直径。
1.4怀牛膝茎叶多糖提取液的抗氧化活性[14-15]
邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出超氧阴离子，生成的中间产物在紫外区有吸收。经波长扫描，在320 nm处有最大吸收[16-17]。经一段时间扫描，该反应在4 min后趋于平缓。羟自由基是最活泼的，反应速率极快，它是对机体危害最大的自由基。利用Fenton反应产生羟自由基：H2O2 +Fe2+=•OH +OH- +Fe3+，通过Fe3+与邻二氮菲生成红色配合物，加入提取液后，减弱了•OH对Fe2+／邻二氮菲的氧化作用，引起吸光度变化来检测自由基的清除情况。
1.4.1怀牛膝茎叶多糖对超氧阴离子自由基（O2-•）清除活性
取试管两只，先加入0.05 mol／L pH是8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 mL，放在25 ℃的水中恒温保持20 min，各自加稀释过的样品溶液2 mL和25 mmol／L的邻苯三酚溶液0.5 mL，混合均匀后在25 ℃的水中反应5 min，最后加6 mol／L HCl 1 mL终止实验反应。于波长320 nm处测量吸光度A2，空白的对照实验组用试样的溶剂来代替实验样品，它的吸光值A1。因为样品溶液自身在波长320 nm处会有吸收，所以用一样体积的样品液来代替邻苯三酚，此吸光值为A3。实验要求每次处理需做三个重复。