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    注:等JM109单菌落加入PCR小管后再加Taq酶
    扩大:PCR反应体系扩大到50μL做2管(1管对照)

    图2-3 50μL PCR反应体系
    试剂名    反应组    对照组
    10×PCR buffer    5.0μL    5.0μL
    phoS1    2.0μL    2.0μL
    phoS2    2.0μL    2.0μL
    Mg2+    3.0μL    3.0μL
    dNTP    2.0μL    2.0μL
    Taq    1.0μL    1.0μL
    去离子水    35μL    35μL
    JM109单菌落    加    不加
    注:等JM109单菌落加入PCR小管后再加Taq酶
    PCR之后取5μL电泳(DL2000 Marker)。
    2.4磷酸盐吸附试验
    2.4.1 标准曲线的制作
    1)准确吸取0,0.5,1,2,3,4 mL磷酸盐标准溶液(1 mL含0.1 mg PO43-),分别加入到6支50 mL比色管中,用去离子水稀释至10 mL;
    2)向各比色管中准确加入4 mL钼酸钠-硫酸溶液及1 mL 0.15%硫酸肼溶液(w/v),混匀,放入沸水浴中煮沸10 min,取出,立即流水冷却,用去离子水稀释至刻度,混匀;
    3)以试剂空白为对照,在波长660 nm处进行分光光度测定。以吸光度为纵坐标,磷酸盐(以PO43-计)含量(毫克)为横坐标绘制标准曲线。
    2.4.2 磷酸盐浓度的测定
    1)将1 mL上清液,30 mg亚硫酸钠,4 mL钼酸钠-硫酸溶液和5 mL去离子水加入比色管,沸水浴中煮沸10 min,取出;
    2)向管中加入1 mL 0.15%硫酸肼溶液,混匀后继续煮沸10 min,取出,用流水冷却并用去离子水稀释至刻度,混匀;
    3)以试剂空白为对照,在波长660 nm处测定其吸光度,从标准曲线上查得相应的总无机磷酸盐(以PO43-计)含量(毫克)。
    2.4.3活菌磷酸盐吸附能力实验
    1)大肠杆菌待测菌株在50 mL无机磷培养基中,37 ºC震荡培养至对数生长中期(OD600=0.6~0.8),用0.1 mmol/L IPTG于20 ºC诱导24 h;假单胞菌待测菌株在50 mL无机磷培养基中,28 ºC震荡培养12 h;
    2)以8000 r/min,2 min离心收集菌体,灭菌去离子水洗涤菌体,用含0.5 mg/mL PO43-的磷酸二氢钾溶液调整菌液至OD600为1.0,置于室温摇床上,每隔1 h取1 mL样品,以8000 r/min,2 min离心,取上清;
    3)按照2.4.2的方法测定磷酸盐浓度。
    2.4.4热致死菌磷酸盐吸附能力试验
    将50 mL培养好的待测菌液以8000 r/min离心2 min,收集菌体,去离子水洗涤1次并于42 ºC烘干过夜。取一部分菌体用灭菌去离子水重悬,涂布LB平板,在相应温度下培养24 h,以确认菌体是否死亡,余下菌体用含0.5 mg/mL PO43-的磷酸二氢钾溶液调整至OD600为1.0,置于室温摇床上,5 h后取1 mL菌液以上述磷酸盐吸附能力测定方法测定上清中磷酸盐含量(详见2.4.2)。
    2.5生长曲线的测定
    以受体菌JM109为对照,将重组菌接种于无机磷培养基于37℃培养,每隔4h取一次样测定OD600值。绘制生长曲线,确定重组质粒的导入是否对大肠杆菌的生长产生影响。
    3结果分析
    3.1 pMB109质粒的提取
    将用质粒小量抽取试剂盒提取的质粒上样于0.8%琼脂糖凝胶,电泳结果见图3-1,由图可知质粒提取成功。
     
    图3-1  提取质粒电泳图
    泳道1,2:标记为MB109的菌种中提取的质粒pMB109

    3.2 PCR扩增phos基因
    以提取的质粒为模板,用能扩增phoS基因的引物对phoS1和phoS2进行PCR扩增,反应结束后,将PCR产物上样于0.8%琼脂糖凝胶,电泳结果见图3-2,由图可知PCR产物大小与phoS基因大小相符,表明进行磷酸盐吸附实验的重组菌正确。
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