酵母多糖发酵条件的优化研究(5)

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1.2.1.2 粗多糖的精制

经过上述方法提取得到的粗多糖，经常会含有一些蛋白质、无机盐和小分子化合物等杂质，在分离、纯化多糖之前，首先必须对粗多糖进行简单的精制，除去非多糖类杂质。○1有机溶剂除杂质：最常用的方法时用有机溶剂沉淀法，利用了多糖易溶于水而会从有机溶剂中析出的特性，一般采用80%乙醇沉淀，静止醇析，大部分多糖都能够沉淀析出，大多需要反复进行几次有机溶剂沉淀后，才能够使大部分杂质去除[7]。○2透析法除杂质：采用透析法去除多糖分子中的小分子杂质是利用了多糖分子量比较大的特性。通常将多糖溶于适量的水中，置于3000～10000 Da的透析袋内，用水溶液透析。透析法对于去除多糖中无机盐以及低分子量的水溶性物质是一种较好的方法。○3除蛋白：由于蛋白质与多糖都是属于强极性的生物大分子，多糖提取液中含有蛋白质是一个普遍的现象，因此，多糖分离中的去除蛋白质是一个不可或缺的重要步骤。经典的Sevage法就是利用氯仿和丁醇有机溶剂使蛋白质变性的特点，加入多糖水溶液5倍体积的氯仿，然后加入氯仿5倍体积的正丁醇，剧烈震荡混合物后，在离心机中离心10分钟左右。变性的蛋白质在水层与溶剂层交界处，这个方法条件温和，连接键在处理后不易断裂，性质不变。但是采用此方法去除蛋白质，需要重复5次左右才能去尽蛋白质，多糖损失较大，且步骤复杂、过程费时。此外还有酶法和鞣酸法[8]。○4脱色：在多糖的提取过程中，会有大量的色素存在，影响进一步的分离纯化，因此必须采用一定的方法除去样品中的色素。脱色的方法很多，比如氧化法、离子交换法、吸附法、金属络合物法等。a．离子交换法是通过离子交换柱色谱来脱色，和分离离子强度不同的多糖。通过利用不同树脂对粗多糖的脱色效果进行比较，发现阴离子大孔交换树脂D280和D390的脱色效果最好，脱色率达到84.3%和76.4%。比较活性炭吸附法和DEAE-纤维素法等多种方法对野生糙皮侧耳子实体多糖的脱色素效果，结果发现DEAE-纤维素法的脱色效果非常明显，不过在其实验中，活性炭法效果最佳。b．吸附脱色法也是一种常用的脱色方法，一般采用吸附树脂、活性炭等吸附剂，使其吸附色素达到纯化的目的。其中活性炭和吸附树脂应用的比较多，在利用活性炭进行脱色时温度、时间、活性炭量等因素会影响脱色效果。杨云等通过比较活性炭吸附法和吸附树脂法对大枣多糖的脱色效果，发现吸附树脂法的效果优于活性炭。除了以上方法外，金属配合法、三氧化铝柱色谱、聚酰胺柱色谱等方法都可以用于粗多糖的脱色，研究过程中应当根据实验室实际情况、多糖色素组成成分的性质等，选择合适的脱色方法。

1.2.1.3 多糖的分离纯化

分离、纯化是将均一的多糖组分从多糖混合物中分离出来，实质上分离和纯化是相辅相成的。分离纯化一般可按分子形状、分子大小和分子所带基团的性质进行分离。如按分子形状和分子大小分离的方法有分部沉淀、超滤、分子筛色谱分离方法等按分子所带基团的性质分离的方法有电泳和离子交换色谱法等。对于多糖常用的纯化方法有○1分部沉淀法：根据不同多糖的溶解度在不同浓度的醇或酮中不同的性质，将比例从小到大加入这些醇或酮。如首先加入少量的醇或酮，将分子量最大的部分多糖先沉淀出来，然后逐步提高醇或酮的浓度，使多糖按分子量由大到小从溶液中析出来。因此，利用分部沉淀法可以依次将不同分子量多糖分离开来，但采用分部有机溶剂沉淀得到的一般仍为混合多糖，需要采用色谱方法等进行进一步的纯化。○2超滤法：超滤法是利用机械筛分的原理，在外压的作用下，选择性地分离出溶液中大颗粒溶质。在外在压力的作用下，分子直径远小于超滤膜孔径的溶质，会透过超滤膜；分子直径和超滤膜孔径大小差不多的溶质，则会被吸附于膜表面；分子直径远大于超滤膜孔径的溶质，会留在超滤膜内侧。在使用超滤法分离多糖类成分的时候，要根据分离的多糖分子的大小，考虑合适的超滤膜孔径、压力、温度和分离时间。○3盐析法:根据不同多糖在不同浓度盐溶液中具有不同溶解度的性质，为了使不同多糖逐步析出。常用的盐析剂有KCl、NaCl、(NH4)2SO4等，其中以(NH4)2S04最佳。盐析法成本低，但效率不高，并且在沉淀过程中有时还会出现共沉淀现象，因此在使用盐析法纯化多糖的时候，应当考察多糖溶液的浓度、溶液pH值等因素。○4离子交换柱色谱法：离子交换剂分为:a.阴离子交换柱色谱，适合于分离各种酸性、中性多糖和黏多糖。酸性多糖容易吸附在交换剂上在溶液pH为6的条件下，中性多糖却不容易吸附。然后用pH相同，但离子强度不同的缓冲液将酸性强弱不同的酸性多糖分别洗脱下来。b.阳离子交换柱色谱适用于碱性多糖，但此种交换剂同时也能吸附中性多糖，所以很少采用阳离子交换剂。此外，还有硼砂型离子交换剂柱色谱法，用于中性多糖的分离，此方法利用中性多糖能与硼砂形成配合物的特性，不同浓度的硼砂溶液洗脱可将不同的中性多糖分离出来。多糖的结构决定着多糖在交换剂上的吸附力。在阴离子交换剂上，吸附力随多糖分子中酸性基团的增加而增加。直链多糖比分支多糖更容易吸附，分子量较大线状分子多糖吸附力较强。根据经验，对于相对分子质量为10万左右的多糖，lg样品大约需用100g DEAE-纤维素。因此，实际应用中应当根据实际情况，确定上样量的多少，避免柱子对样品过载，降低分离效果。○5凝胶柱色谱法：凝胶柱色谱是多糖分离纯化中常用的方法之一。常用亲水性凝胶是由葡聚糖和甘油基通过醚桥相交联而成的多孔性网状结构，比如葡聚糖凝胶(Sephadex)等。交联度对凝胶网状结构中孔隙的大小有直接的影响，交联度越大，吸水时膨胀也越小，反之，交联度越小，吸水时膨胀的程度也越大。根据交联度的不同，所能分离的多糖分子的大小也不同。