早在1753年瑞典植物学家就已经建立了植物花属,但是到目前为止杜鹃属的分类问题还是无法解决,后来经过许多研究者的探索与实践,分类系统经历数次变更【11-13】,出现了经典分类学,解剖学【14】,数量分类学【15】,化学分类学【16】等大量的研究报告,但是仍然有很多的基本问题得不到合理解决,比如说杜鹃属的系统进化与繁殖发育。分子标记(Randomly Amplified Polymorphic DNA)在植物的分子遗传学研究中具有操作方便,简单易懂,模板用量少,便于转移以及分析扩增产物的优点,是分子方向研究中一项非常重要的工具,可以用来解决杜鹃属植物分类的问题。还有虽然我国杜鹃属植物种类繁多,拥有世界上一半以上的杜鹃品种,但是由于杜鹃花植物绝大部分属于野生或者是半野生,有很多种类都无法进行分类及命名,取材也比较困难,再加上有一部分杜鹃种类材料特别稀少,导致其资源开发和整体利用水平相对较低,因此,为了高效科学和相关实验研究的需要,我们对杜鹃属植物基因组DNA的提取方法进行了必要的优化。
1.材料与方法
1.1实验材料
该实验所采用的是锦绣杜鹃植物叶片,均从周口师范学院校园内选取。采摘的是相对较为新鲜的叶片,带回实验室后,用清水洗去其表面污物,用滤纸吸干叶片表面的残留水渍,然后放到超净工作台进行风干。本试验采用单因素试验设计。
1.2实验试剂与药品
实验所用到的试剂与药品有:
新配好的2 X CTAB缓冲提取液:1 M Tris-Hcl、3.5 M Nacl、O.5 M EDTA ;
O.5 M EDTA : ddH2O, NaOH, Na2EDTA·2H2O,PH值调至8.0;1.0 M Tris-Hcl:Tris,ddH2O,浓Hcl,PH值调至8.5; 50 X TAE:Tris、冰乙酸、0.5 M EDTA;24:1氯仿异戊醇,异丙醇,乙醇,琼脂粉,核酸染料,buffer,marker等。这些试剂都是由周口师范学院提供。
1.3实验方法
本实验采用的是改良后的CTAB法【17-18】。CTAB法提取DNA是目前为止应用最多的一种方法,它的原理是利用CTAB(即十六烷基三甲基溴化胺)与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物从而使核酸释放。但是由于植物细胞中所含的成分复杂多样,比如说各种酶类,尤其是氧化酶类,还有糖类等,会对DNA的抽提产生很大的不良影响,因此,一些人通过改良CTAB法从而提高提取效果。
在这次的实验中,我们使用的是2XCTAB,250ml2XCTAB提取液配方:1M Tris-Hcl(PH8.5)25ml,0.5M EDTA(PH8.O)100ml,3.5M Nacl100ml,混匀后加5gCTAB溶解,定容至250ml。在2XCTAB抽提液中加入一点点PVP和2ul巯基乙醇,其目的就是为了防止褐化,防止植物细胞内的一些成分物质氧化成醌类,因为植物组织中富含多糖以及一些多酚类物质,对后续的实验研究非常不利。故改良的CTAB法能够有效地去除这些物质,并能在之后的各步离心中去除污染物。