利用转录组学研究甘薯响应黑斑病的分子机制(2)

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致谢 . 22
1 绪论甘薯又称地瓜、红薯、芋头等，具有防癌、降血压等功效，改革开放前曾流传“一年甘薯半年粮”、“甘薯救活了一半人”的说法，甘薯由于其独特的高产性和适应性，缓解了由于人口激增带来的温饱问题。中国作为世界上甘薯种植面积最大的国家，常年种植面积在 560万公顷左右，年总产量超过 900亿公斤，居第四位[1]，仅次于水稻、小麦和玉米，且甘薯营养价值高，其块根中含有大量的可溶性糖、淀粉、维生素和多种氨基酸，还含有丰富的脂肪、蛋白质、食物纤维以及铁和钙等矿物元素，营养价值不亚于米和面[2]。近年来甘薯种植面积呈下降趋势，政府和中国甘薯科技工作者努力提高甘薯的产量，但甘薯产业仍存在新品种推广速度慢、产需矛盾突出、种植机械化程度低、害虫存在加重趋势、产后加工技术水平低等问题，使得甘薯产业进展缓慢[3]。甘薯黑斑病是影响甘薯产量的三大病害之一，据统计，我过每年由于黑斑病造成的损失在 5%-10%，严重时可达50%[2]，人和家畜使用病薯后可引起中毒甚至导致死亡。由于黑斑病传播途径广、防治难度大，优选高抗或免疫品种是防治黑斑病的最佳途径，但高抗品种稀少、免疫品种几乎不存在，因此筛选抗病基因建立基因文库研发转基因高抗品系是最经济实用的方法。本研究将介绍采用高通量测序技术针对病斑直径和病斑深度两个性状的10个高抗品系和 10个抵抗品系的转录组进行测序，通过基因差异性分析，筛选出可能与黑斑病抗性相关的基因，再通过进一步实验筛选黑斑病抗性基因，从分子水平上优化育种。
1.1甘薯黑斑病病菌致病机理黑斑病的致病菌为甘薯长喙壳菌，于 1890 年Halsted 在美国首次发现，1919年传入日本，由日本鹿儿岛出入我国辽宁省[4]。该病菌对温度的适应能力较弱，生长适宜温度为9~36℃，半致死温度平均为 51~53℃；但病菌对于酸碱度的适应范围较广
，在pH3.7~9.2的环境下均可生长，其中最适 pH为6.6[5]。病菌在适宜条件下可大量繁殖，主要从植物的切口侵入，其侵染过程分为三步：①感病：当植物与病菌亲和互作时，病菌通过其分泌的纤维物质紧紧固定在寄主细胞壁上，从而侵入栓穿过细胞壁侵入寄主细胞，并进行增殖和转移，破坏植物叶绿体的结构和功能，出现褪绿或花叶[6]。②增殖：病菌依靠寄主的能源进行增殖，通过子囊孢子进行有性生殖或产生内生分生孢子和厚垣孢子进行无性生殖，分生孢子寿命较短，子囊孢子和后垣孢子寿命较长。③转移：病菌通过胞间连丝和维管束进行转移，最终使整棵植株染病。 1.2甘薯黑斑病的防治在农田育种上主要采用农业防治为主、药剂防治为辅的综合防治方法： ①培育无病幼苗：精选抗病种薯，根据染病程选用药剂对种薯进行消毒。由于病菌对温度适应能力若弱，进行高温育苗。 ②大田防治：在移栽幼苗前阻断传染源，主要采用髙剪苗和药剂浸苗。髙剪苗是指栽植前将坑面 3.33cm 以上剪下，秧苗基本不带病；药剂浸苗是用 50%的代森铵或托布津500 浸苗10min，防治效果达 90%以上。 ③建立无病留种田：所用的秧苗、土壤、肥料和灌溉用水均不携带病菌，在种植过程中注意防治病菌的侵入，栽植时选用二次髙剪苗，一般选3 年以上未种植甘薯的无病基地。 ④安全储藏：以防冻伤，在晴天进行收获并剔除病薯和伤薯，入窖前对窖进行石灰水或 1%甲醛溶剂喷雾消毒，入窖后高温处理，维持在 35~37℃，储藏时则调至10~17℃，注意控制窖藏湿度和散热[8]。
1.3转录组测序概念及其过程上述方法治标不治本，想要快捷有效地防治黑斑病，要从甘薯黑斑病对黑斑病相关的抗性基因上入手，改良甘薯品系，从根本上杜绝黑斑病。由于基因组内容庞大，测序成本高，因此选择信息量相对较小的转录组进行测序。转录组的概念由 Velcuescu 等提出[9]，广义上指特定活细胞中所有转录出来的 RNA 的总和，包括核糖体 RAN（tRNA）、信使 RNA（mRNA）、转运 RNA（tRNA）以及非编码 RNA（ncRNA）,狭义则指参与蛋白质翻译的信使 RNA（mRNA）[10]。转录组测序（RNA sequencing）是功能基因基因组学的一个重要方面，其优势在于不需要知道目标物的基因信息而对其转录组进行高效快捷地分析，打破了人类对转录组认识的局限，目前已成功对水稻、拟南芥、玉米等模式生物进行了测序[11]。所有用于 DNA 测序的技术均可用于 RNA 测序[12]，包括第一代测序技术（基因芯片）Sanger测序法的 SAGE、下一代测序技术（高通量测序技术）的 RNA-Sequencing[13]。随着科技的发展，Sanger 测序法局限性日益突出，21世纪初，以 Roche公司454 技术，I11umina公司的SOLEXA 技术和ABI公司的 SOLID 技术为代表的高通量测序技术，具有高通量、速度快、成本低等优点，人类可以利用高通量测序技术同时对数百万个 DNA分子进行测序，认识一个物种转录组和基因组[14,15]。这三个测序技术平台各有优缺点：454 技术读长最长，可达400bp，但费用高、出错率高，在非模式生物中运用最广泛源!自`751'文"论/文`网[www.751com.cn；SOLEXA技术读长200bp，但灵活性差，不适用于小数据的测量，由于其性价比最高，是目前最广泛运用的测序技术；SOLID 技术读长最短，为 100bp，精确度高，成本低，但耗时长[16]。三者的操作原理都是先提取样本所有的 RNA,分离和纯化mRNA，随后采用物理方法如超声波将 mRNA 打成测序平台所需要的长度的片段，用引物和逆转录酶反转录成 cDNA，连接测序机头，利用琼脂糖凝胶电泳筛选合适的片段，进行 PCR 扩增，达到一定丰度后上机测序。收集到足够数据后，再进行生物信息分析，有测序数据的参考测序数据，否则从头组装，构建 Unigene库，最后进行Unigene 库分析、GO和KEGG 分析[17]。若样本数在两份以上，则进行基因差异性分析。笔者的工作是在前人已得出的数据的基础上对数据进行分析。