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    1.3.4.2 最佳三元菌混合比例的确定
    选取酵母菌、霉菌、芽孢菌以及乳酸菌作为三元菌菌种。将种子菌悬液按照最佳二元菌混菌和第三种产酯酶菌4:0、4:1、4:2、4:3、4:4、0:4的比例配制成混合菌液,将种子菌悬液按照最佳二元菌混菌和乳酸菌4:0、4:1、4:2、4:3、4:4的比例配制成混合菌液。将配制好的混合菌液按照4%的接种量接种于100 mL发酵培养基上,30℃、135 r/min条件下连续培养3-5 d,测其酯化酶活力,酶活力最高的混菌比例为最佳混菌比例。
    1.3.4.3 最佳混菌发酵接种量的确定
    选择最佳的多元菌株混合比例配制成复合菌悬液,将复合菌悬液按照2%、4%、6% 、8% 的接种量分别接种于100 mL发酵培养基中,30℃ 、135 r/min条件下连续培养3-5 d,测其酯化酶活力,酶活力最高的接种量为最佳接种量。
    1.3.4.4 最佳混菌发酵初始pH值的确定
    选择最佳的多元菌株混合比例配制成复合菌悬液,并将复合菌悬液按照最佳接种量分别接种到pH值为3、4、5、6、7的100 mL基础培养基上,30℃、135 r/min 条件下连续培养3-5 d,测其酯化酶活力,酶活力最高的pH值为其最佳初始pH值。
    1.3.4.5 最佳混菌发酵生长温度的确定
    选择最佳的多元菌株混合比例配制复合菌悬液,将配制好的复合菌悬液按照最佳接种量接种到最适初始pH值的培养基上,分别置于27℃、30℃、33℃、36℃温度梯度下,连续培养3-5 d,测其酯化酶活力,酶活力最高的温度为其最佳生长温度。
    1.4 多元菌混合发酵条件的优化     
    多元菌混合发酵条件的优化在单因素最佳水平基础上,以接种量、发酵温度、初始pH值为影响因素,设计正交试验表(见表4),进行3因素3水平的正交试验。
    1.5 酯化酶活力的测定[15]
    1.5.1 粗酶液的制备
    取适量经摇床培养好的发酵培养基于离心管中,4℃、5000 r/rain离心15 min得上清液即为粗酶液,并放入4℃冰箱中保存。
    1.5.2 酯化酶活力测定
    将10 mL环己烷、6.25 mL己酸、3.25 mL乙醇、1.17 g无水硫酸钠以及0.2 mL酶液置于100 mL三角瓶中,36℃密闭培养24 h后取上清液0.5 mL于50 mL三角瓶中,加入5 mL蒸馏水,2滴酚酞,用0.05 mol/L的氢氧化钠滴定至出现微红色,测定己酸的消耗量。
    酶活力单位定义:在测定条件下1 min消耗1 μmol己酸所需要的酶量为1个酶活力单位。
    2.结果与分析
    2.1 酯化酶的分离与筛选
    2.1.1 酯化酶芽孢菌的分离与筛选
     
    图1 产化酯酶芽孢菌产生的透明圈情况

    表1 产酯化酶芽孢菌产生透明圈的情况
    菌株编号    透明圈直径
    (R/ mm)    菌落直径
    (r/mm)    比值R/r
    (平均值)
    芽1    12    16    15    7    12    10    1.516
    SPM1    12    14    8    9    10    5    1.444
    SPM2-1    7    8    6    4    5    3    1.783
    SPM2-2    8    7    8    5    4    5    1.533
    SPM3-1    12    6    8    10    4    6    1.344
    SPM3-2    15    9    12    11    7    8    1.383
    SPh1    -    -    -    -    -    -    -
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