GASBD(s)蛋白的表达纯化与淀粉亲和性分析(2)

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SBD最根本的功能就是能与生淀粉结合[3,4]。具体点来说，在完整的淀粉酶中，SBD具有三个不同的作用：SBD可以促使酶与不溶性底物在溶液中相互作用；将底物带到酶的催化区域(CD)的活性位点中；在某些特定情况下，它还可以破坏淀粉粒的表面结构[5]。SBD主要应用于生物活性蛋白的分离纯化，这对于工业和科研领域而言具有重大意义，例如，Dalmia等[6]在大肠杆菌中进行β-半乳糖苷酶-SBD融合蛋白的表达纯化研究；所谓SBD转基因平台技术就是将不具备淀粉亲和性或与淀粉亲和性低的一些具有特殊作用的外源酶蛋白的编码序列与SBD基因序列相连，再利用转基因技术将含有SBD的融合基因转到作物体内，例如，Ji等[7]就将环状芽孢杆菌环状糊精糖基转移酶（CGTase）SBD的编码序列与马铃薯GBSSI信号肽序列融合在一起，在马铃薯GBSSI启动子的控制下，使SBD在无直链淀粉的马铃薯突变体(amf)的块茎中表达；SBD还能够控制淀粉颗粒的大小，在工业中，天然的和经化学修饰的淀粉粒是最有用的生物大分子；SBD还能应用于益生菌食品领域，通过SBD技术可以获得黏着性不同的淀粉，这在食品、纺织领域应用广泛。

本实验对重组蛋白GASBD(s) 在大肠杆菌BL21 (DE3) 中的表达水平进行了SDS–PAGE分析，并通过Ni2+–NTA亲和层析的方法对蛋白可溶性表达部分进行了纯化。然后对纯化的GASBD(s) 蛋白与不溶性淀粉结合进行定性分析。

2 实验材料

2.1 菌株

含有质粒pET28a-GASBD(s)的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

2.2 仪器

台式冷冻恒温振荡箱，电磁炉，分光光度计，高压蒸汽灭菌锅，垂直板电泳槽及配套的玻璃板，电热恒温鼓风干燥箱，磁力加热搅拌器，pH计，超净工作台，恒温恒压电泳仪，脱色摇床，电子天平，通风柜，凝胶成像仪等。

2.3 试剂

1M IPTG、50μg/ml Kana、20mM Tris-HCL(pH8.0)、10%(W/V)过硫酸铵、结合缓冲液、5×Tris-Glycine buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)、100mM NaAc缓冲液(pH 6.0)、洗脱缓冲液、5×SDS-PAGE loading buffer、考马斯亮蓝R-250染色液、考马斯亮蓝染色脱色液、20mM咪唑、300mM咪唑、20%乙醇(树脂保存液)、5×Tris-Glycine buffer(NADE电泳缓冲液)、5×NDAE loading buffer Ni2+-NTA购自于Novagen公司，IPTG、Kana、溶菌酶、考马斯亮蓝R-250、聚丙烯酰胺、过硫酸铵、咪唑购自于南京天为公司、玉米淀粉购自于Sigma公司。

2.4 培养基

LB培养基（Luria–Bertani培养基）、TB培养基（Tartoff- Hobbs Broth/Terrific Broth，1987）的配制参考《分子生物学实验指南》（第2版）。

3 实验方法

3.1 重组蛋白的诱导表达与分析

挑取含有重组质粒pET28a-GASBD(s)的大肠杆菌BL21(DE3)的菌落，接种于10 mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，220rpm振荡培养12h。取该培养液2 mL，以1：100转接于200 mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C，220rpm的条件下，培养至细胞浓度OD600 为0.8时，加入IPTG（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）至最终浓度为1.0 mM，在37°C下继续诱导培养5h后收集培养菌体。没有添加IPTG 的培养液继续培养5h后作为对照。

取200 mL培养液，在4℃下，5000 g离心10min，收集培养菌体。菌体沉淀用50 mL Tris-HCl (20mM，pH 8.0) 洗涤两次；然后菌体沉淀用20mL裂解液 (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0) 重新悬浮，冰上放置30min。最后在冰水中用超声波破碎仪 (VCX750, SONICS, USA) 对菌体进行破碎20min（破碎3s，间隔6s），功率为300W。菌体裂解液用15% SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 进行分析。通过诱导表达的菌体总蛋白样品与没有添加诱导剂的对照进行比较来确定重组蛋白的表达。